本文要點(diǎn)：急性腎損傷(AKI)具有嚴(yán)重的短期或長(zhǎng)期并發(fā)癥，發(fā)病率和死亡率高，對(duì)健康構(gòu)成極大威脅。開(kāi)發(fā)高性能的NIR-II探針，通過(guò)NIR-II熒光和光聲雙模成像實(shí)現(xiàn)AKI的wu創(chuàng)原位檢測(cè)具有重要意義。然而，NIR-II發(fā)色團(tuán)通常具有大共軛性和疏水性，這使得它們無(wú)法被腎臟清除，限制了它們?cè)谀I臟疾病的檢測(cè)和成像中的應(yīng)用。本文研制了一種具有腎臟清除、水溶性和被激活生物標(biāo)志物且具有良好光穩(wěn)定性等特點(diǎn)的探針（PEG3-HC-PB）。該探針的熒光(900 – 1200 nm)由于具有吸電子作用的苯硼基團(tuán)(響應(yīng)元件)的存在而猝滅，在830 nm處有一個(gè)微弱的吸收峰。但在AKI的腎區(qū)存在過(guò)表達(dá)的H2O2的情況下，苯硼基團(tuán)被轉(zhuǎn)化為苯羥基，從而增強(qiáng)了NIR-II熒光發(fā)射(900?1200 nm)和吸收(600?900 nm)，最終產(chǎn)生明顯的光聲信號(hào)和可用于成像的NIR-II熒光發(fā)射。該探針能夠通過(guò)對(duì)生物標(biāo)記物H2O2的響應(yīng)，使用實(shí)時(shí)3D-MSOT和NIR-II熒光雙模成像技術(shù)檢測(cè)造影劑誘導(dǎo)的和缺血/再灌注誘導(dǎo)的小鼠AKI。因此，該探針可以作為檢測(cè)AKI的實(shí)用工具；此外，它的設(shè)計(jì)策略可以為其他具有多種生物學(xué)應(yīng)用的大共軛NIR-II探針的設(shè)計(jì)提供借鑒。

背景：急性腎損傷通常有嚴(yán)重的短期或長(zhǎng)期并發(fā)癥，發(fā)病率和死亡率高，如果不及時(shí)治療，甚至可能成為危及生命的疾病。AKI的準(zhǔn)時(shí)監(jiān)測(cè)對(duì)于及時(shí)采取行動(dòng)防止其發(fā)展為更嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括高血壓、急性肺水腫、心律失常和慢性腎臟疾病等至關(guān)重要。目前，在醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，特定的生物標(biāo)記物常被用來(lái)篩查亞臨床疾病和診斷特定的疾病，因?yàn)檫@些生物標(biāo)記物在相關(guān)疾病的部位經(jīng)常以異常高的水平過(guò)度表達(dá)。一些生物標(biāo)志物不僅存在于疾病部位，而且還存在于其他器官和/或組織中，而一些生物標(biāo)志物(例如，活性氧(ROS))壽命短，因此在疾病部位對(duì)特定生物標(biāo)志物的非侵入性原位檢測(cè)/成像，有望成為準(zhǔn)確診斷特定疾病以及揭示與疾病相關(guān)的發(fā)病機(jī)制的理想方法。

近紅外第二窗口(NIR-II，900-1700 nm發(fā)射)的熒光成像具有固有的優(yōu)勢(shì)，即組織中的光線散射較弱，自發(fā)熒光很少，因此可以以更高的分辨率和更深入的方式實(shí)時(shí)成像，有助于更準(zhǔn)確地診斷疾病和了解疾病的進(jìn)展。光聲成像方法通過(guò)收集樣品中的光吸收劑產(chǎn)生的超聲波，對(duì)穿透深度大和分辨率高的樣品進(jìn)行成像。尤其是，多光譜光聲層析成像(MSOT)通過(guò)采用多波長(zhǎng)的激光照射樣品來(lái)檢測(cè)樣品中不同光吸收劑產(chǎn)生的超聲信號(hào)；并且通過(guò)光譜分解來(lái)確定每個(gè)光吸收劑的光譜特征，從而可以跟蹤特定光吸收體的光聲信號(hào)。同時(shí)，其3D(三維)圖像可以很容易地獲取或生成，從而促進(jìn)疾病部位的準(zhǔn)確定位和對(duì)其大小的評(píng)估。適合NIR-II熒光和光聲雙模成像的探針是非常有用的，因?yàn)樗峁┑男畔⒖梢韵嗷ヲ?yàn)證。在腎損傷部位，包括H2O2在內(nèi)的ROS水平升高，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)，相應(yīng)地導(dǎo)致組織損傷增加，炎癥加重。腎損傷部位的內(nèi)源性H2O2可能是一種有前景的原位生物標(biāo)志物。因此，利用可以進(jìn)行NIR-II熒光成像和光聲成像的探針，對(duì)AKI進(jìn)行原位檢測(cè)，是準(zhǔn)確定位AKI的理想方法。

然而，由于腎臟濾過(guò)閾值小于6 - 8nm(腎小球?yàn)V過(guò)屏障)，要達(dá)到腎臟可清除的程度，物質(zhì)必須足夠小，沒(méi)有不適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)結(jié)合導(dǎo)致大聚集體或顆粒。足夠的水溶性有助于減少或避免與蛋白質(zhì)的結(jié)合。因此環(huán)糊精或聚乙二醇(n=3?45，聚乙二醇)等親水基團(tuán)常常用于對(duì)一些發(fā)色團(tuán)(或探針)的修飾，使其在近紅外di一窗口發(fā)射(近紅外-I，700?900發(fā)射)或可見(jiàn)光范圍(Vis，400?700 nm發(fā)射)可用于腎臟成像。由于這些NIR-I或Vis發(fā)色團(tuán)(探針)的共軛長(zhǎng)度相對(duì)較短，因此它們?cè)诒挥H水性基團(tuán)修飾后通常不會(huì)與蛋白質(zhì)顯著結(jié)合。相比之下，用于制備N(xiāo)IR-II成像探針的NIR-II發(fā)色團(tuán)通常具有長(zhǎng)共軛和疏水性的結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)往往導(dǎo)致較差的水溶性，在水生物環(huán)境中容易聚集成大顆粒，以及其與蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合，阻礙了這些生色團(tuán)在腎臟中的清除。由此，為了確保成像探針是腎臟清除的，從而可以用來(lái)有效地檢測(cè)和成像，探針是水溶的，尺寸小于6?8 nm。

七甲基花菁類(lèi)染料是一類(lèi)重要的近紅外發(fā)色團(tuán)，其較易于進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以將其熒光拓展到NIR-II波段，且吸收系數(shù)高。但它們的長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)和疏水性通常造成其無(wú)法被腎臟清除，從而限制了它們?cè)谀I臟疾病檢測(cè)和成像中的應(yīng)用。過(guò)去的研究試圖通過(guò)在染料的兩端引入親水基團(tuán)來(lái)改善這些染料的水溶性，但并不一定會(huì)使它們變成腎臟清除。例如，已被FDA批準(zhǔn)用于臨床應(yīng)用的吲哚青綠(ICG)是水溶性的，因?yàn)榻雍辖Y(jié)構(gòu)的兩側(cè)都引入了親水磺酸基，但它仍然是被肝臟清除，而不是被腎臟清除；這是因?yàn)橹虚g的結(jié)合骨架仍然疏水，很容易與體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致形成的顆粒太大而不能被腎臟清除；采用PEGn(n=3?45)作為親水性基團(tuán)也是如此，如方案1A所示。

為了充分發(fā)揮七甲基菁染料的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服其相對(duì)較差的光穩(wěn)定性，開(kāi)發(fā)一種可用于檢測(cè)和成像AKI的NIR-II熒光和光聲雙模成像探針，本研究設(shè)計(jì)了具有腎臟清除、水溶性和生物標(biāo)志物可激活且具有良好光穩(wěn)定性的PEG3-HC-PB探針。該探針的設(shè)計(jì)策略包括以下三個(gè)方面：(1)在兩端和中間引入三個(gè)親水和生物相容的PEG3基團(tuán)(方案1B)，將疏水的共軛骨架分段，從而確保水溶性，避免與蛋白質(zhì)結(jié)合；(2)在中心環(huán)己烯基的底部和頂部分別引入叔丁基和酰胺基(方案1B)，導(dǎo)致空間位阻增加，共軛骨架的電子密度降低，防止染料因親電攻擊而光漂白；(3)將反應(yīng)元件(苯基硼酸基)引入中心部分，開(kāi)發(fā)了生物標(biāo)志物可激活探針(PEG3-HC-PB)，用于H2O2原位反應(yīng)NIR-II熒光和光聲雙模成像檢測(cè)小鼠AKI(方案1B)。該探針的熒光(900?1200 nm，峰值位于950 nm)由于吸電子的苯硼基團(tuán)的存在而被猝滅，在830 nm處有一個(gè)較弱的吸收峰。但在AKI的腎區(qū)存在過(guò)表達(dá)的H2O2的情況下，苯硼基團(tuán)被轉(zhuǎn)化為苯羥基，從而增強(qiáng)了NIR-II熒光(900?1200 nm)和吸收帶(600?900 nm)，最終產(chǎn)生明顯的NIR-II熒光信號(hào)和光聲信號(hào)用于成像。該探針能夠通過(guò)對(duì)生物標(biāo)記物H2O2的響應(yīng)，使用實(shí)時(shí)3D-MSOT和NIR-II熒光雙模成像技術(shù)檢測(cè)造影劑和缺血/再灌注誘導(dǎo)的小鼠AKI。

Scheme 1

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

1）PEG3-HC-PB探針的合成及性能研究。

完成探針PEG3-HC-PB和生色團(tuán)PEG3-HC-POH(理論上是PEG3-HC-PB與H2O2反應(yīng)的產(chǎn)物)的合成后，首*行蛋白吸附試驗(yàn)，以確認(rèn)水溶性的探針和生色團(tuán)是否與蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合并形成聚集體，影響腎臟對(duì)其的清除。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明。探針和發(fā)色團(tuán)對(duì)蛋白質(zhì)的吸附很低，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)的結(jié)合骨架被位于兩端和中間的三條生物兼容的PEG3鏈分割。

由于探針PEG3-HC-PB是水溶性的，所以在pH 7.4的PBS中測(cè)試了它的光譜性質(zhì)和對(duì)H2O2的響應(yīng)。圖1A，B顯示，隨著H2O2水平的增加，PEG3-HC-PB探針在900?1200 nm范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(峰值發(fā)射在950 nm)；而在沒(méi)有H2O2的情況下，其熒光相當(dāng)弱。隨著探針PEG3-HC-PB與H2O2反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度相應(yīng)增加，并在35分鐘左右達(dá)到平衡。圖1C顯示了探針PEG3-HC-PB在沒(méi)有或有H2O2的情況下的吸收光譜，很明顯，隨著H2O2劑量的增加，在600?900 nm處的吸光度增加(峰值吸光度在830 nm處)。接著測(cè)量用不同劑量的H2O2處理探針PEG3-HC-PB后的光聲信號(hào)，在680?900 nm范圍內(nèi)，光聲信號(hào)在約830 nm處，且光聲信號(hào)隨著H2O2劑量的增加而增加（圖1D）。以上結(jié)果表明，PEG3-HC-PB探針能夠有效地響應(yīng)H2O2，從而發(fā)出明顯的光聲信號(hào)以及用于H2O2檢測(cè)的NIR-II熒光信號(hào)。

接著使用808 nm激光(250 mWcm?2)連續(xù)照射60min，考察探針PEG3-HC-PB與H2O2以及生色團(tuán)PEG3-HC-POH孵育后的光穩(wěn)定性。如圖1E所示，與H2O2和發(fā)色團(tuán)PEG3-HC-POH孵育后的探針PEG3-HC-PB較IR808和ICG具有更好的光穩(wěn)定性。探針PEG3-HC-PB與H2O2或發(fā)色團(tuán)PEG3-HC-POH孵育后，即使在連續(xù)激光照射60min后，也只顯示出輕微的熒光信號(hào)損失，而ICG和IR808被快速光漂白，表明該探針和發(fā)色團(tuán)具有良好的光穩(wěn)定性。良好的水溶性、低蛋白質(zhì)結(jié)合率、良好的光穩(wěn)定性以及對(duì)H2O2的響應(yīng)都證明了該探針設(shè)計(jì)策略的有效性。

實(shí)驗(yàn)測(cè)試了該探針對(duì)H2O2響應(yīng)的選擇性和抗干擾性。為此目的，分別加入H2O2 (140 μM)或其他生物相關(guān)和潛在的干擾物質(zhì)(半胱氨酸、谷胱甘肽、L-異亮氨酸、酪氨酸、谷氨酸、丙氨酸、葡萄糖、精氨酸、NaNO2, Na+ , K+ , Ca2+, Mg2+, NaClO, and ONOO?) 35min后，測(cè)量其在950 nm處的熒光強(qiáng)度。圖1F顯示，在探針(20 μM)與H2O2 (140 μM)反應(yīng)時(shí)，熒光顯著增強(qiáng)。相比之下，探針與其他物質(zhì)的反應(yīng)只產(chǎn)生微弱的熒光強(qiáng)度。此外，這些物質(zhì)中的每一種與H2O2共存對(duì)探針對(duì)H2O2的熒光強(qiáng)度幾乎沒(méi)有任何影響。在加入H2O2 (65 μM)和其他每種物質(zhì)的情況下，也測(cè)量了探針(10 μM)的光聲信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，只有在探針(10 μM)與H2O2 (65 μM)反應(yīng)后，光聲信號(hào)才明顯增強(qiáng)，而探針與其他物質(zhì)反應(yīng)后僅能觀察到輕微的光聲信號(hào)。這些物質(zhì)中的每一種與H2O2共存對(duì)探測(cè)器在光聲信號(hào)方面對(duì)H2O2的響應(yīng)沒(méi)有影響。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針PEG3-HC-PB可以作為一種H2O2激活的顯像劑，具有明顯的熒光信號(hào)和光聲信號(hào)，且對(duì)H2O2的響應(yīng)具有良好的選擇性和抗干擾性。

為了確定探針PEG3-HC-PB對(duì)H2O2的反應(yīng)機(jī)理，如方案1B所示，記錄了探針溶液與H2O2反應(yīng)后的吸收光譜和熒光光譜，并與合成的生色團(tuán)PEG3-HC-POH進(jìn)行了比較?？梢钥吹轿展庾V和熒光光譜非常相似，表明探針PEG3-HC-PB與H2O2反應(yīng)后轉(zhuǎn)化為生色團(tuán)PEG3-HC-POH。進(jìn)一步通過(guò)高效液相色譜和HR-MS的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，如圖1G所示，探針與H2O2反應(yīng)后在保留時(shí)間5.83分鐘出現(xiàn)一個(gè)新的峰，與發(fā)色團(tuán)PEG3-HC-POH一致，而保留時(shí)間為2.71分鐘的峰減少，與探針Peg3-HC-PB一致，證實(shí)了PEG3-HC-PB與H2O2反應(yīng)后已轉(zhuǎn)化為PEG3-HC-POH。此外，還進(jìn)行了HR-MS測(cè)量，對(duì)于與H2O2反應(yīng)后的探針PEG3-HC-PB(圖1H)，明顯地在m/z 1150.6726處出現(xiàn)了與PEG3-HC-POH([M]+)相匹配的新峰。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了H2O2裂解PEG3-HC-PB中的硼酸基(識(shí)別元件)，最終產(chǎn)生生色團(tuán)PEG3-HC-POH。

在進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前，對(duì)PEG3-HC-PB探針的生物安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)組小鼠由尾靜脈注射溶于生理鹽水的探針PEG3-HC-PB，對(duì)照組為健康小鼠，比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兩組小鼠體重的差異。結(jié)果表明兩組小鼠的體重沒(méi)有明顯差異。采用HE染色對(duì)兩組小鼠的主要臟器組織進(jìn)行組織學(xué)分析，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間的差異不大。對(duì)于激活的探針PEG3-HC-POH，血液循環(huán)半衰期約為75分鐘?；罨奶结樦饕?h內(nèi)在腎臟內(nèi)蓄積，并在靜脈注射后24h內(nèi)被清除。此外，還測(cè)定了健康小鼠在靜脈注射24小時(shí)后對(duì)PEG3-HC-PB探針的腎清除效率，約為83%。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了探針PEG3-HC-PB具有良好的生物安全性，適合于體內(nèi)生物成像。

Figure  1

2）造影劑誘發(fā)小鼠急性腎損傷的影像研究。

首先嘗試應(yīng)用PEG3-HC-PB探針在小鼠體內(nèi)檢測(cè)造影劑DTZ誘導(dǎo)的AKI。DTZ在臨床上用于尿路造影，由于其被腎臟清除，經(jīng)常引起包括腎小管上皮細(xì)胞毒性和腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變?cè)趦?nèi)的不良反應(yīng)，造成急性腎損傷。H2O2在各種AKI的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，并且在AKI時(shí)的腎區(qū)過(guò)度表達(dá)，可以作為AKI的內(nèi)源性原位生物標(biāo)志物。按文獻(xiàn)報(bào)道的方法靜脈注射不同濃度的DTZ建立AKI小鼠模型。如圖2A所示，小鼠靜脈注射DTZ后24小時(shí)，靜脈注射探針PEG3-HC-PB，對(duì)小鼠進(jìn)行NIR-II熒光成像和MSOT成像實(shí)驗(yàn)。如圖2B、C所示，在NIR-II熒光圖像中，由于腎臟代謝的原因，腎區(qū)的熒光信號(hào)在注射探針后約5小時(shí)內(nèi)增加，然后減弱，直至24小時(shí)消失。隨著DTZ劑量的增加，NIR-II熒光信號(hào)增強(qiáng)，DTZ水平越高，腎臟損傷越嚴(yán)重。圖2D顯示，與對(duì)照組(健康小鼠組)相比，模型小鼠的腎臟隨著DTZ劑量的增加而變得蒼白和腫脹(水腫)。這些結(jié)果再次提示DTZ可引起AKI，且腎臟損傷隨DTZ劑量的增加而加重。此外，圖2E顯示了注射探針PEG3-HC-PB后5小時(shí)各組小鼠主要器官(包括心、肺、肝、脾和腎臟)的NIR-II熒光強(qiáng)度；圖2F顯示了不同組小鼠主要器官的NIR-II熒光圖像，其中腎臟的熒光信號(hào)較強(qiáng)，且腎臟的熒光強(qiáng)度隨DTZ劑量的增加而增強(qiáng)，這與體內(nèi)NIR-II成像數(shù)據(jù)一致。此外，與對(duì)照組(健康小鼠)相比，隨著DTZ水平的增加，小鼠的體重出現(xiàn)了更明顯的下降，進(jìn)一步證實(shí)了DTZ對(duì)腎臟的毒性。

Figure  2

接著用探針PEG3-HC-PB通過(guò)MSOT成像檢測(cè)造影劑(DTZ)誘導(dǎo)的AKI。圖3A、B顯示了靜脈注射探針PEG3-HC-PB后不同時(shí)間記錄的小鼠MSOT橫斷面圖像。與正常對(duì)照組(即健康小鼠組)相比，在靜脈注射探針5h后，模型組小鼠腎臟MSOT信號(hào)增強(qiáng)，DTZ水平升高(圖3A)。MSOT成像結(jié)果顯示，在注射PEG3-HC-PB探針后，腎臟MSOT信號(hào)增強(qiáng)，并在5h時(shí)并達(dá)到峰值，隨后由于腎臟代謝的原因，MSOT信號(hào)減弱。接著，為了從不同的角度證實(shí)對(duì)比劑DTZ誘導(dǎo)的AKI，用肌酐測(cè)定試劑盒和尿素測(cè)定試劑盒測(cè)定了小鼠的SCR和BUN。給予較高劑量DTZ的小鼠，SCR和BUN水平均明顯高于對(duì)照組(健康小鼠)（圖3C，D）。此外，從三組小鼠靜脈注射探針PEG3-HC-PB(圖3E)后覆蓋部分小鼠軀干的3D-MSOT圖像可以明顯看出，接受高劑量DTZ的小鼠腎區(qū)MSOT信號(hào)比對(duì)照組強(qiáng)得多（圖3E）。顯然，這些MSOT成像結(jié)果與NIR-II熒光成像數(shù)據(jù)具有很好的一致性。上述結(jié)果也證實(shí)了DTZ劑量越大，腎損傷越嚴(yán)重。

然后對(duì)各組小鼠的主要臟器進(jìn)行MSOT成像。與其他器官相比，注射DTZ的模型鼠腎臟的MSOT信號(hào)要明顯得多。對(duì)不同組小鼠腎組織切片的進(jìn)行組織學(xué)分析，圖3F中的H&E染色圖像顯示，與對(duì)照組(健康鼠)相比，模型組小鼠腎小管擴(kuò)張和空泡化變性。DTZ高劑量組腎臟損害較低劑量組明顯加重，進(jìn)一步證明造影劑確實(shí)對(duì)腎臟有損害，且隨著造影劑劑量的增加，腎損傷程度加重。

Figure  3

3）小鼠腎缺血/再灌注性急性腎損傷的影像研究。

在小鼠腎缺血/再灌流(I/R)所致急性腎損傷模型中進(jìn)一步驗(yàn)證PEG3HC-PB探針的應(yīng)用。腎I/R損傷是AKI的一種(主要臨床癥狀是快速腎功能障礙，發(fā)病率和死亡率高)。在腎I/R損傷時(shí)，腎臟過(guò)度產(chǎn)生H2O2，從而導(dǎo)致局部炎癥和細(xì)胞凋亡加劇，進(jìn)一步加重腎臟損傷。利用PEG3-HC-PB探針，通過(guò)對(duì)腎臟內(nèi)源性H2O2的反應(yīng)來(lái)檢測(cè)I/R導(dǎo)致的AKI。采用3組小鼠，其中1組為對(duì)照組(健康小鼠行無(wú)缺血的中線切開(kāi)手術(shù))，2組為模型組(即健康小鼠通過(guò)夾閉雙側(cè)腎蒂造成不同時(shí)間(30或60min)的缺血，然后再灌流24 h)。圖4A顯示了腎臟I/R損傷的過(guò)程和雙模成像實(shí)驗(yàn)。在腎缺血/再灌流誘導(dǎo)的AKI小鼠模型的外科手術(shù)過(guò)程中，在缺血30或60分鐘后，腎臟的顏色由血紅變?yōu)樯钭仙?，然后在血液再灌流時(shí)又恢復(fù)為紅色(去除血管夾后)。

圖4B、C的NIR-II熒光圖像和熒光強(qiáng)度顯示，在注射PEG3-HC-PB探針后5h，對(duì)照組腎臟區(qū)域幾乎沒(méi)有熒光，而模型組腎臟區(qū)域有明顯的熒光信號(hào)。與缺血時(shí)間短(缺血時(shí)間30min，再灌注時(shí)間24h)相比，缺血時(shí)間長(zhǎng)(缺血60min，再灌流時(shí)間24h)組的熒光信號(hào)更明顯，這可能是由于缺血時(shí)間較長(zhǎng)(60min)，導(dǎo)致腎臟產(chǎn)生更多的H2O2，從而導(dǎo)致更嚴(yán)重的腎損傷。圖4D顯示了每組小鼠器官(包括心、脾、肝、肺和腎)在靜脈注射探針PEG3-HC-PB后5小時(shí)的NIR-II熒光圖像，其N(xiāo)IR-II熒光強(qiáng)度如圖4E所示。從這些圖中可以看到，在主要器官中，腎臟的熒光信號(hào)要強(qiáng)得多，并且隨著缺血時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度也增加，這與NIR-II活體成像數(shù)據(jù)是一致的。如圖4F所示，與對(duì)照組相比，缺血60分鐘的模型小鼠的腎臟變得蒼白，并有明顯的水腫。這些數(shù)據(jù)表明，增加缺血持續(xù)時(shí)間會(huì)加劇AKI。此外，與對(duì)照組相比，隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠的體重下降更加明顯，這進(jìn)一步證實(shí)了隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，腎臟缺血?再灌注損傷變得更加嚴(yán)重。

Figure  4

繼續(xù)，利用探針PEG3-HC-PB對(duì)腎I/R損傷進(jìn)行MSOT成像檢測(cè)和成像。圖5A、B為小鼠靜脈注射PEG3-HC-PB后不同時(shí)間段的MSOT橫斷面圖像。與對(duì)照組相比，在靜脈注射探針PEG3-HC-PB后5 h，模型小鼠腎區(qū)出現(xiàn)明顯的MSOT信號(hào)(圖5A)。采集靜脈注射PEG3-HC-PB后不同時(shí)間的MSOT圖像。MSOT成像結(jié)果顯示，在注射探針PEG3-HC-PB后，腎區(qū)MSOT強(qiáng)度增強(qiáng)，約5h達(dá)到峰值，隨后由于腎臟代謝作用，MSOT強(qiáng)度緩慢減弱(圖5B)。通過(guò)商業(yè)試劑盒(肌酐和尿素分析試劑盒)檢測(cè)每組小鼠的SCR和BUN水平，進(jìn)一步證實(shí)了I/R誘導(dǎo)AKI的可靠性。如圖5C，D所示，缺血時(shí)間較長(zhǎng)的小鼠，SCR和BUN水平均明顯高于對(duì)照組，且缺血時(shí)間越長(zhǎng)，腎臟損傷越嚴(yán)重。從三組小鼠靜脈注射探針PEG3-HC-PB后覆蓋部分小鼠軀干的3D-MSOT圖像(正交視圖圖像)(圖5E)也可以明顯看出，缺血時(shí)間較長(zhǎng)的小鼠腎區(qū)MSOT信號(hào)明顯強(qiáng)于對(duì)照組。

然后對(duì)三組小鼠的主要器官進(jìn)行MSOT成像。模型組(缺血時(shí)間為30或60分鐘，再灌注時(shí)間為24小時(shí))小鼠腎臟的MSOT信號(hào)較其他器官?gòu)?qiáng)，且隨著腎臟缺血時(shí)間的增加，MSOT信號(hào)逐漸增強(qiáng)。這與體內(nèi)影像學(xué)觀察一致，腎缺血時(shí)間越長(zhǎng)，腎損傷程度越重。對(duì)三組小鼠的腎組織切片進(jìn)行組織學(xué)分析，如圖5F所示。在H&E染色圖像中，與對(duì)照組相比，缺血時(shí)間較長(zhǎng)組(60min)和缺血時(shí)間較短組(30min)均有明顯的腎小管擴(kuò)張和空泡化變性。并且，缺血時(shí)間越長(zhǎng)(60min)，腎臟損害越嚴(yán)重。以上結(jié)果都證實(shí)腎臟I/R確實(shí)可引起腎臟損傷，且缺血時(shí)間越長(zhǎng)，急性腎損傷程度越重。

Figure  5

結(jié)論：本研究設(shè)計(jì)的PEG3-HC-PB探針具有良好的光穩(wěn)定性、水溶性、腎臟清除性和生物標(biāo)記物的活性，可用于通過(guò)NIR-II熒光和MSOT雙模成像的技術(shù)檢測(cè)活體AKI。

在AKI的情況下，腎臟中病理水平的H2O2激活探針PEG3-HC-PB，導(dǎo)致發(fā)色團(tuán)PEG3-HC-POH的釋放，并相應(yīng)地釋放強(qiáng)烈的NIR-II熒光信號(hào)和光聲信號(hào)。該探針已被用于檢測(cè)造影劑(DTZ)和腎臟腎缺血/再灌注誘導(dǎo)的小鼠AKI，可作為MSOT和NIR-II熒光雙模成像檢測(cè)和監(jiān)測(cè)AKI的可操作工具。此外，3D-MSOT圖像可以以時(shí)空方式用來(lái)定位疾病部位。這一策略可能為設(shè)計(jì)響應(yīng)其他生物標(biāo)志物的基于七甲基花菁的NIR-II探針以及設(shè)計(jì)其他用于疾病成像應(yīng)用的NIR-II探針提供新的視角。

參考文獻(xiàn)

Zeng, C., Tan, Y., Sun, L., Long, Y., Zeng, F., & Wu, S. (2023). Renal-Clearable Probe with Water Solubility and Photostability for Biomarker-Activatable Detection of Acute Kidney Injuries via NIR-II Fluorescence and Optoacoustic Imaging. ACS Appl Mater Interfaces, 15(14), 17664-17674.

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