本文要點(diǎn)：活體動(dòng)物的生理學(xué)研究常常具有侵入性，受到身體yue束、麻醉甚至an樂(lè)死的限制。使用不受物理和化學(xué)約束的非侵入性方法在臨床前研究被廣泛應(yīng)用。如計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)和磁共振成像(MRI)，但由于時(shí)間分辨率低、視野要求低以及對(duì)造影劑的靈敏度有限，其在自由移動(dòng)的小鼠中的應(yīng)用有限。光學(xué)技術(shù)與熒光劑偶聯(lián)能夠提供行動(dòng)自由老鼠的結(jié)構(gòu)、功能、遺傳或代謝對(duì)比，已經(jīng)作為替代方案出現(xiàn)。短波紅外(SWIR, 1,000-1,700 nm)熒光成像在可視化小鼠生物結(jié)構(gòu)方面表現(xiàn)出色。

SWIR區(qū)域的光物理特性使其成為了光學(xué)體內(nèi)成像的best方案，許多SWIR發(fā)射探針被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括臨床批準(zhǔn)的吲哚菁綠(ICG)和相關(guān)的有機(jī)染料，以及量子點(diǎn)、碳納米管和稀土摻雜納米顆粒等用于實(shí)現(xiàn)SWIR成像。此外，SWIR敏感相機(jī)技術(shù)的進(jìn)步提高了成像的分辨率、靈敏度和效率，如基于InGaAs的探測(cè)器。

SWIR成像已被廣泛用于小鼠血管檢測(cè)、代謝活動(dòng)評(píng)估、可視化淋巴血管和生命體征監(jiān)測(cè)等，但大多數(shù)應(yīng)用于麻醉動(dòng)物。相關(guān)研究表明SWIR成像能夠應(yīng)用于自由活動(dòng)的小鼠。本篇文章結(jié)合高對(duì)比度SWIR發(fā)射熒光團(tuán)和SWIR檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了多達(dá)4個(gè)不同通道的實(shí)時(shí)多通道成像記錄，在自由活動(dòng)的小鼠中實(shí)現(xiàn)了非侵入性腦活動(dòng)和腦外周器官串?dāng)_成像，具有巨大潛力。

1. 自由行為小鼠光學(xué)成像的實(shí)驗(yàn)策略

本篇文章中作者使用了ICG, JuloChrom5, Chrom7和JuloFlav7，可以在1-10 ms的曝光時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行非侵入性的清醒小鼠成像。同時(shí)，為了獲得best的染料激發(fā)，熒光團(tuán)吸收光譜與多色實(shí)驗(yàn)中使用的激光線相結(jié)合（圖1）。

圖1

除水溶性的ICG外，其它染料都被包裹在脂質(zhì)膠束中用于體內(nèi)注射。為了檢測(cè)清醒小鼠器官的SWIR熒光發(fā)射，作者使用了一個(gè)提供小鼠全身視野的35 mm F/1.4鏡頭和一個(gè)max幀率為300幀每秒(fps)、分辨率為640 × 512像素的單色InGaAs探測(cè)器。檢測(cè)窗口可以選擇1000或1150納米的長(zhǎng)通濾光片，這取決于每個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用的熒光團(tuán)和激光線。

2. 行為自由的小鼠成像的快速采集

對(duì)清醒和自由移動(dòng)的小鼠進(jìn)行成像需要高時(shí)間和空間分辨率以及有利的對(duì)比度來(lái)解析生物參數(shù)，同時(shí)考慮動(dòng)物運(yùn)動(dòng)。例如，在自然運(yùn)動(dòng)中的老鼠搖晃和搔頭，作者發(fā)現(xiàn)10毫秒(相當(dāng)于100 fps)的暴露時(shí)間對(duì)分辨主要的熒光標(biāo)記血管是必要的。然而，一些較小的血管只能在3ms時(shí)觀察到（相當(dāng)于300 fps）（圖2）。

圖2. 3ms時(shí)獲取的單幀圖像，以及該幀圖像與相鄰幀圖像的比較

3. 在自由行為小鼠中標(biāo)記和可視化主要血管

為了使血管標(biāo)記，長(zhǎng)循環(huán)膠束配方的Chrom7被靜脈注射，注射后45分鐘成像。作者觀察到信號(hào)集中在眼眶周圍的主要血管、顱底和后肢(背側(cè)視圖;圖3)。圖像使用968 nm光源和1000 nm長(zhǎng)通濾波，以300 fps的速度獲得。同時(shí)將視頻顯示速度從300幀/秒降至30幀/秒;然后用慢動(dòng)作顯示鼠標(biāo)的快速運(yùn)動(dòng)，大多數(shù)血管仍然可以分辨出來(lái)。這說(shuō)明SWIR成像不僅可以保持全小鼠視野，還能分辨小鼠的精細(xì)結(jié)構(gòu)。

圖3. SWIR熒光血管成像小鼠在成像室中自由運(yùn)動(dòng)

4. 熒光團(tuán)多路復(fù)用在多通道對(duì)社會(huì)互動(dòng)小鼠進(jìn)行正交成像

多路復(fù)用成像是臨床前成像研究的關(guān)鍵特征。作者利用了激發(fā)-多路復(fù)用概念:熒光團(tuán)激發(fā)匹配的激光波長(zhǎng)以交替順序打開(kāi)，同時(shí)使用一組長(zhǎng)通濾波器在單個(gè)檢測(cè)窗口中收集熒光發(fā)射。這種多路復(fù)用策略不僅有利于速度，而且保持了一致的分辨率和對(duì)比度（圖4）。

圖4. 多熒光團(tuán)成像策略示意圖: 四種不同的激光匹配四個(gè)選定的熒光團(tuán)的激發(fā)光譜與InGaAs探測(cè)器同步

為了標(biāo)記不同的生物結(jié)構(gòu)，作者采用了不同的注射策略，并利用了熒光團(tuán)的不同生物分布的性質(zhì)。循環(huán)中的ICG分子被肝臟中的肝細(xì)胞迅速吸收，并通過(guò)膽道排泄到腸道。根據(jù)注射后的時(shí)間，肝臟和腸道可以以高的信背比（signal-to-background ratio）可視化。為了使腸道可視化，小鼠在ICG靜脈注射后5-6小時(shí)成像。巨噬細(xì)胞豐富的器官，如肝臟、淋巴結(jié)和骨骼，在JuloChrom5膠束靜脈注射24小時(shí)后信號(hào)豐富；使用這種策略來(lái)提供骨/解剖對(duì)比。成像前30-90分鐘腹腔注射JuloFlav7膠束，與ICG標(biāo)記的腸道一起提供腹腔內(nèi)的補(bǔ)充信息。最后，為了標(biāo)記血管系統(tǒng)，成像前15-30分鐘靜脈注射長(zhǎng)循環(huán)Chrom7膠束。使用相同的實(shí)驗(yàn)方法，作者對(duì)兩個(gè)籠內(nèi)社會(huì)互動(dòng)的小鼠進(jìn)行了成像(圖5)。在本次實(shí)驗(yàn)中，作者選擇1150 nm的長(zhǎng)通濾光片，減少了總收集光，因此將曝光時(shí)間增加到7.8 ms。最終4通道視頻的有效幀率是30fps保證速度，但當(dāng)鼠標(biāo)表現(xiàn)出特別快速的運(yùn)動(dòng)時(shí)，對(duì)較小結(jié)構(gòu)的解析能力有所降低。最后，為了最小化熒光團(tuán)串?dāng)_并避免需要后處理工具來(lái)區(qū)分不同通道，作者通過(guò)降低造影劑濃度，同時(shí)以波長(zhǎng)相關(guān)的方式增加入射激光功率密度。從而獲得了可區(qū)分的成像通道，盡管在單個(gè)通道中存在一些熒光團(tuán)串?dāng)_。

圖5. 成像室內(nèi)小鼠進(jìn)行社交互動(dòng)時(shí)的腹側(cè)成像

5. 從行為自由的老鼠身上追蹤器官

為了確定每個(gè)器官的位置，從帶有標(biāo)記器官的視頻中提取生理相關(guān)數(shù)據(jù)。作者選擇使用用于姿態(tài)估計(jì)的鼠標(biāo)跟蹤算法來(lái)跟蹤小鼠器官，利用深度學(xué)習(xí)方法DeepLabCut用于預(yù)測(cè)自由移動(dòng)的老鼠體內(nèi)器官的位置。首先在數(shù)據(jù)集的小部分(通常是每次實(shí)驗(yàn)幀的10%)上定義感興趣器官周圍的手動(dòng)ROI選擇(標(biāo)記)。這些標(biāo)記不僅放置在目標(biāo)結(jié)構(gòu)上，還放置在外周結(jié)構(gòu)上，以使整個(gè)小鼠(背側(cè)或腹側(cè))能夠?qū)R。然后DeepLabCut使用這個(gè)初始選擇來(lái)訓(xùn)練自己的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，最后使用訓(xùn)練好的模型來(lái)預(yù)測(cè)剩余幀上每個(gè)區(qū)域的位置，同時(shí)作者為了將來(lái)的數(shù)據(jù)提取，在處理管道中將目標(biāo)結(jié)構(gòu)的每個(gè)標(biāo)記都被轉(zhuǎn)換到視場(chǎng)的中心，外圍標(biāo)記圍繞中心標(biāo)記旋轉(zhuǎn)，以便鼠標(biāo)的姿態(tài)在不同的幀中對(duì)齊。最后，可以在結(jié)果對(duì)齊圖像堆棧的目標(biāo)結(jié)構(gòu)上繪制ROIs，最終用于從跟蹤器官中提取定量信息。

6. SWIR熒光成像在神經(jīng)科學(xué)研究中的應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)和前景

盡管本篇文章提出的宏觀SWIR熒光成像管道與神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用似乎相去甚遠(yuǎn)，但值得注意的是，SWIR成像已被用于透過(guò)皮膚和顱骨的可視化麻醉小鼠的小腦血管或血腦屏障滲漏研究，wu創(chuàng)宏觀SWIR成像顯示其他器官(如腸道和肝臟)的能力也表明，非侵入性腦動(dòng)力學(xué)成像在自由行為小鼠的直接或間接腦成像中有著合理前景，有諸多潛在應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

Arús, B. A.; Cosco, E. D.; Yiu, J.; Balba, I.; Bischof, T. S.; Sletten, E. M.; Bruns, O. T., Shortwave infrared fluorescence imaging of peripheral organs in awake and freely moving mice. Frontiers in Neuroscience 2023, 17.

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