本文要點：具有NIR-II窗口熒光發(fā)射的熒光探針由于其成像深度的增加而得到了廣泛的研究。然而，目前報道的NIR-II熒光探針存在合成路線復(fù)雜、熒光量子產(chǎn)率(QYs)低等缺點。在NIR-II探針的研制中可采用屏蔽策略來提高其量子產(chǎn)率，但目前這種策略僅用于對稱的NIR-II探針的設(shè)計，特別是那些基于苯并[1,2-c:4,5-c ']雙([1,2,5]噻二唑)(BBTD)骨架的探針。本文報道了一系列基于屏蔽策略的不對稱NIR-II探針，這些探針具有合成路線簡單、高合成率(90%以上)、高QYs和大斯托克位移等優(yōu)勢。進一步使用D-α-生育酚基聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)作為NIR-II熒光探針(NT-4)的表面活性劑，以提高探針的水溶性，得到TPGS-NT-4 NPs。體內(nèi)研究表明，具有高QY(3.46%)的TPGS-NT-4 NPs可實現(xiàn)高分辨率的血管造影和有效的局部光熱治療，同時具有良好的生物相容性。本文通過結(jié)合血管造影和局部光熱治療來提高腫瘤對納米光熱劑的吸收，同時減少其對正常組織的損傷。

背景：近紅外窗口（NIR；700-1700 nm）的熒光團在腦血流和腫瘤微環(huán)境的探測中可以提供高對比度的圖像。但NIR-I熒光團（NIR-I，700-900 nm）臨床應(yīng)用受到其穿透深度不足（約0.22 mm）的阻礙，NIR-II熒光團（NIR-II，1000-1700 nm）具有更深的穿透深度（約3 cm）、更大的空間分辨率（約100 nm）和良好的信噪比（SBR）等特性，因此，探針的激發(fā)波長從NIR-I到NIR-II的深色位移將提高探針的組織穿透深度。

迄今，已報道的有機NIR-II探針根據(jù)其化學(xué)工程策略可分為兩大類：1）結(jié)構(gòu)與花青染料相似的NIR-II探針；2）基于BBTD的供體-受體-供體（D-A-D）熒光團。有機NIR-II熒光團往往由于其分子內(nèi)和分子間相互作用的堆積而導(dǎo)致熒光淬滅，量子產(chǎn)率低。可以通過提高空間位阻來防止聚集進而提高量子產(chǎn)率，如采用屏蔽策略。屏蔽策略指的是添加一個官能團，使分子骨架扭曲，從而增加分子間空間位阻，減少分子內(nèi)和分子間的相互作用，進而減少分子激發(fā)態(tài)向周圍水分子的能量轉(zhuǎn)移。Dai的研究小組引入了通過交替屏蔽單元、電子給體和受體設(shè)計的具有更高QY的NIR-II探針。噻吩及其衍生物EDOT近年來也常常用于探針的設(shè)計，可作為熒光團的第二給體以及橋接基團。值得注意的是，EDOT被證明在獲得適當(dāng)?shù)姆肿踊兒突谄帘尾呗蕴岣逳IR-II熒光團的QYs方面優(yōu)于噻吩。本文分別使用噻吩和EDOT作為第二給體和橋接分子來構(gòu)建NT-1和NT-2熒光團。結(jié)果顯示NT-2與EDOT在DCM中的QY為6.31%，比NT-1(Scheme 1)高1.8倍。

Scheme 1

另一種提高QY的創(chuàng)新策略是電荷屏蔽效應(yīng)，即通過引入兩性離子電荷來減少分子的凈電荷。還可以通過疏水或疏水分支屏蔽熒光團的分子結(jié)構(gòu)來減少熒光團與水分子之間的相互作用。本文在熒光團的設(shè)計中采用疏水受體（1,8-萘內(nèi)酰亞胺）來達到上述目的。同時，1，8-萘內(nèi)酰亞胺還可以有效地將熒光紅移到NIR-II窗口。雙鍵的增加也有利于π-共軛體系的拓展，本文通過增加橋聯(lián)雙鍵來進一步使熒光團的發(fā)射紅移，并得到了熒光團NT-3和NT-4（Scheme 1）。

此外，構(gòu)建高產(chǎn)、合成簡單、副產(chǎn)物少的的NIR-II探針對于臨床轉(zhuǎn)化是很重要的。與以往報道的對稱D-A-D NIR-II熒光團相比，本研究設(shè)計的NIR-II熒光團系列(NT-1、NT-2、NT-3、NT-4)的合成路線簡單，產(chǎn)率超過90%，且具有不對稱D-π-A結(jié)構(gòu)。根據(jù)已有的報道，不對稱結(jié)構(gòu)的能量遷移是部分可逆的，這對于減少熒光團的光漂白有利。這也就進一步賦予分子恰當(dāng)?shù)撵`活性和熒光強度/熒光持久范圍，以更好地滿足血管造影的需要，并提供更好的空間分辨率和對比度，以解決微血管分布和進行灌注分析。

基于分子設(shè)計策略和實驗結(jié)果，NT-4被作為后續(xù)研究的候選物。為了提高其溶解度和細胞滲透性，進一步用TPGS（被FDA批準的具有抗氧化和抗炎作用）包封NT-4。TPGS使熒光團具有隱身效果。水中TPGS-NT-4 NPs的QY為3.46%，與已有報道的NIR-II探針的QY相比處于中上水平，滿足NIR-II熒光成像的要求。體內(nèi)血管造影實驗顯示，TPGS-NT-4 NPs是一種有效的NIR-II成像探針。尾靜脈注射TPGS-NT-4 NPs后，裸鼠后肢血管的高斯半峰寬度(FWHM)為495 μm，濾光率為1300 LP, SBR為2.57。此外，通過右股動脈局部注射TPGS-NT-4 NPs可以很好地顯示腫瘤血管。

毫無疑問，將納米藥物有效地輸送到腫瘤組織，同時減少對正常組織的損傷是一項艱巨的挑戰(zhàn)。本研究通過結(jié)合血管造影和局部光熱治療來提高納米光熱劑對腫瘤的吸收，同時減少其對正常組織的損傷。在NIR-II熒光引導(dǎo)下局部注射TPGS-NT-4治療劑量，然后進行光熱治療。在輻照期間產(chǎn)生的健康組織損傷將大大減少。H&E染色證實了TPGS-NT-4 NPs具有良好的生物相容性。隨后，本文還研究了TPGS-NT-4 NPs的光熱性質(zhì)。實驗結(jié)果證實TPGS-NT-4 NPs具有良好的光熱隔熱性能和優(yōu)異的光熱穩(wěn)定性。體內(nèi)光熱治療實驗也進一步證實TPGS-NT-4 NPs具有開發(fā)用于局部治療的光熱劑的潛力。

實驗內(nèi)容：

1）探針的合成、表征及光學(xué)性質(zhì)研究

通過選擇低電子密度受體(化合物10)和高電子密度給體(4-乙基- N, N -二甲基ben胺)，并以噻吩為橋接結(jié)構(gòu)，設(shè)計了探針NT-1的不對稱D-A結(jié)構(gòu)。NT-1的合成通過一個簡單的過程完成(圖1A)。合成反應(yīng)的產(chǎn)率為92%，與目前報道的NIR-II熒光探針相比，收率非常高。根據(jù)已報道的研究，采用屏蔽策略可以有效地提高NIR-II探針的QYs，這是由于共軛主鏈阻礙了分子間相互作用或阻止了聚集。據(jù)此，本文設(shè)計并合成了以EDOT取代噻吩的NT-2。EDOT作為第二給體和橋接基團具有扭曲分子骨架的作用，從而降低分子間的相互作用。NT-3和NT-4是通過延長雙鍵來獲得發(fā)射波長的紅移而得到的。NT-2、NT-3、NT-4的收率也較高，分別為92%、90%、91%。用1H NMR、13C NMR和質(zhì)譜對這4個化合物進行了表征，證實了結(jié)構(gòu)的正確性。

Figure 1

對NT-1、NT-2、NT-3和NT-4的光學(xué)性質(zhì)進行深入的研究。如圖1A-D所示，四種小分子化合物在近紅外窗口均有吸收，四種化合物在DCM中的max吸收波長分別為840、860、880和915 nm。此外，隨著溶劑極性的增加，四種探針的紫外-可見吸光度都出現(xiàn)了顯著的藍移效應(yīng)。有趣的是，在含有10% DMSO的水溶液中，這四種化合物的吸收都藍移到約650 nm。推測光譜藍移是由于這四種化合物的水溶性差，它們都是大的共軛體系，聚集在極性溶劑中。

隨后，在808 nm光激發(fā)下，四種探針的熒光發(fā)射都在NIR-II窗口，特別是在DCM和DMSO中(圖1E-H)。四種化合物單體的max熒光發(fā)射波長分別在1095、1050、1130和1110 nm處，而探針的低聚物在1200 nm處有一個肩峰。具有大斯托克斯位移的探針在生物成像中具有更高的信噪比(SBR)，四種化合物的Stokes位移分別為287、242、322和302 nm。本文還簡要分析了四種分子結(jié)構(gòu)的LUMO和HOMO軌道。四種探針的HOMOs均沿共軛主鏈離域，而LUMOs主要位于受體上。與NT-1和NT-3相比，含有EDOT的探針(NT-2和NT-4)表現(xiàn)出較少的離域LUMOs，并且可以調(diào)節(jié)靜電勢能的分布(圖1B)。比較NT-2和NT-4，NT-4的雙鍵延伸后吸收能降低，因此其吸收有明顯的紅移趨勢，這與實驗結(jié)果一致。以IR-26在1,2-二氯乙烷(DCE)中的含量為基準，計算了四種探針的相對QY。NT-1、NT-2、NT-3和NT-4在DCM中的QY分別為3.48%、6.31%、2.75%和4.08%。值得注意的是，在相同的測試條件下，由于引入了EDOT, NT-2和NT-4的熒光強度要高于NT-1和NT-3。產(chǎn)生這種實驗現(xiàn)象的原因可能是由于EDOT的扭曲結(jié)構(gòu)減少了分子間的相互作用?；谒姆N探針的光學(xué)性質(zhì)，本文選擇NT-4作為研究對象，對這種結(jié)構(gòu)不對稱的NIR-II探針進行進一步的修飾和研究，得到TPGS-NT-4 NPs，其熒光量子產(chǎn)率處于中等以上水平。

2）TPGS-NT-4 NPs的制備、表征及性能研究

由于NT-4的水溶性較差，選擇兩親性生物材料D-α-生育酚基聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)對探針進行包封，使其具有生物學(xué)應(yīng)用價值。通過薄膜水合法制備了負載NT-4的納米顆粒(TPGS-NT-4 NPs)，并通過透析去除未包封的NT-4。接著對TPGS-NT-4的結(jié)構(gòu)進行了表征，并對其理化性質(zhì)進行了研究。如圖2A所示，TPGS-NT-4 NPs的粒徑約為15.37 nm，納米顆粒呈電中性。通過透射電鏡(TEM)表征了TPGS-NT-4 NPs的形態(tài)和大小。納米顆粒呈球形，具有光滑均勻的形貌(圖2D)。TPGS-NT-4 NPs的max紫外可見吸收波長為805 nm。圖2B顯示，TPGS-NT-4 NPs與NT-4在DMSO中的紫外-可見吸收相似。這一實驗現(xiàn)象證明，TPGS的包封顯著提高了NT-4的水溶性。TPGS-NT-4 NPs的納米包封率為84%。TPGS-NT-4 NPs的max熒光波長為1020 nm，以IR-26為標準測定的QY為3.46%(圖2C)。TPGS-NT-4 NPs的Stokes位移為212 nm。同時，對納米顆粒的穩(wěn)定性進行了研究。如圖2E和F所示，室溫下放置15天后，TPGS-NT-4 NPs的溶液狀態(tài)、紫外可見吸收光譜和納米顆粒大小均無顯著差異，表明TPGS-NT-4 NPs在室溫下具有良好的穩(wěn)定性。

Figure 2

3）TPGS-NT-4 NPs的NIR-II血管成像研究

首先，通過MTT實驗證實了NT-4和TPGS-NT-4 NPs在高濃度下對細胞沒有毒性。為了證明TPGS-NT-4 NPs可以作為一種新的NIR-II探針用于全身血管成像，對Balb/c裸鼠進行全身和腦血管成像。裸鼠靜脈注射TPGS-NT-4 NPs (200 μL, 0.5 mg/mL) (n = 3)。采用不同濾光片(900 LP、1000 LP、1100 LP、1300 LP)，通過InGaAs相機記錄裸鼠NIR-II圖像。注射TPGS-NT-4 NPs后10分鐘顯示NIR-II血管成像。為了更好地評價TPGS-NT-4 NPs血管成像效果，本研究選擇對腿部血管進行局部血管成像。如圖3A和B所示，在相同的曝光時間(400 MS)下，TPGS-NT-4 NPs在NIR-II窗口1300 LP下的成像分辨率更高。同時，對高斯半頻全寬(FWHM)和信噪比(SBR)進行分析。當(dāng)濾波器為1100 LP時，后肢血管的FWHM為643 μm，而當(dāng)濾波器為1300 LP時，后肢血管的FWHM為495 μm(圖3C和D)。此外，當(dāng)濾波器為1300 LP時，SBR為2.57，顯著高于濾波器為1100 LP時的1.53。隨后，在與腿部血管相似的條件下對裸鼠的腦血管進行成像(圖3E和F)。如圖3G和H所示，F(xiàn)WHM分別為936 μm (1100 LP)和608 μm (1300 LP)。SBR分別為1.42 (1100 LP)和2.43 (1300 LP)。TPGS-NT-4 NPs在注射后24 h左右被代謝。注射TPGS-NT-4 NPs后24 h，對裸鼠(n = 3)進行安樂和解剖，H&E染色分析不同臟器。H&E染色分析實驗顯示，經(jīng)尾靜脈注射TPGS-NT-4 NPs對裸鼠各臟器無明顯損傷，證明TPGS-NT-4 NPs在體內(nèi)具有良好的生物相容性。綜上所述，所有實驗結(jié)果表明，TPGS-NT-4 NPs可以作為NIR-II窗口體內(nèi)血管成像的理想候選。

Figure 3

4）TPGS-NT-4 NPs光熱性質(zhì)研究

雖然NIR-II成像可以增加成像深度，但探針在NIR-II窗口內(nèi)的QYs仍然較低。根據(jù)雅布隆斯基圖理論，NIR-II探針返回基態(tài)所吸收的能量大部分以非輻射形式釋放。本文研究了TPGS-NT-4 NPs的光熱性質(zhì)。在808 nm激光照射下，TPGS-NT-4 NPs的溫度變化(ΔT)隨著激光功率的增強而增大(圖4A)。當(dāng)激光功率密度為0.6 W/cm2時，溫度變化可達33.2℃。同時，納米顆粒的ΔT也隨著濃度的增加呈增加趨勢(圖4B)。為了證明光熱效應(yīng)是由包封藥物引起的，還研究了空殼納米粒子(TPGS NPs)。如圖4C所示，TPGS- NT -4 NPs的光熱效應(yīng)明顯高于水和TPGS NPs。這些結(jié)果證明了NT-4包封探針產(chǎn)生的增溫效應(yīng)。同時，在相同光照條件下，NT-4在DMSO中的光熱性質(zhì)與TPGS-NT-4相似。NT-4的光熱轉(zhuǎn)化率為43%。紅外熱成像圖像進一步證實了TPGS-NT-4 NPs良好的光熱性能，如圖4E所示。最后，對TPGS-NT-4 NPs的光熱穩(wěn)定性進行了監(jiān)測。如圖4D所示，TPGS-NT-4 NPs在90 min (808 nm, 0.6 W/cm2)內(nèi)經(jīng)歷了三個光開關(guān)周期，而top溫度沒有明顯變化。計算TPGS-NT-4 NPs的光熱轉(zhuǎn)化率為45%。對比已報道的光熱劑，TPGS-NT-4 NPs對NIR-II成像的光熱轉(zhuǎn)化率處于中上區(qū)間。由此可見，TPGS-NT-4 NPs具有優(yōu)異的光熱性能，有望開發(fā)為光熱治療劑。

Figure 4

5）TPGS-NT-4 NPs光熱處理效果的體內(nèi)評價

建立4T1腫瘤小鼠模型，來評價TPGS-NT-4 NPs作為光熱劑的治療作用。腫瘤生長后，將實驗小鼠隨機分為4組:對照組、PBS加激光組、TPGS加激光組、TPGS- NT -4 NPs加激光組(n = 3)。本文設(shè)計了一種局部光熱治療聯(lián)合血管造影的方法，旨在提高TPGS-NT-4 NPs的腫瘤攝取，同時max限度地減少對正常組織的損傷。本動物實驗流程如圖5A所示。首先，局部注射TPGS-NT-4 NPs (30 μL, 0.1 mg/mL)至腫瘤附近血管。注射后10分鐘，在近紅外二區(qū)對小鼠局部血管進行成像。如圖5A所示，局部注射部位(紅圈標記)血管亮度顯著，腫瘤(藍圈標記)也呈現(xiàn)熒光。這些結(jié)果表明，TPGS-NT-4 NPs通過血管向腫瘤方向積累。然后對小鼠進行光熱治療(PTT)，獲得小鼠的紅外熱像圖(圖5B)，注射TPGS-NT-4 NPs并進行808 nm激光照射的小鼠，腫瘤區(qū)域溫度明顯升高，照射10 min后達到54.7°C的峰值，而注射nano殼或水的小鼠未觀察到明顯的加熱。隨后，對4T1腫瘤小鼠進行10分鐘的激光照射。然后每2 d記錄不同治療組小鼠的體重和腫瘤大小，連續(xù)14 d。與對照組、激光照射PBS和激光照射TPGS相比，注射TPGS- NT -4 NPs小鼠的腫瘤明顯縮小(圖5C)。為了觀察治療后腫瘤的差異，不同治療組的小鼠在治療周期結(jié)束時被安樂并解剖。圖5E顯示，經(jīng)TPGS-NT-4 NPs治療后，腫瘤明顯縮小甚至消失。同時，在治療期間，相應(yīng)組小鼠的體重沒有顯著差異(圖5D)。不同組腫瘤的TUNNEL染色分析也顯示，激光照射后TPGS-NT-4 NPs在組織水平上具有腫瘤殺傷作用(圖5F)。這些結(jié)果表明TPGS-NT-4 NPs具有出色的光熱處理效果。

Figure 5

結(jié)論：本文報道了一系列具有不對稱D-A結(jié)構(gòu)的新型NIR-II探針(NT-1, NT-2, NT-3和NT-4)。利用噻吩結(jié)構(gòu)作為π橋合成了NT-1探針。基于用EDOT代替噻吩的屏蔽策略設(shè)計了NT-2。由于EDOT能夠扭曲主鏈的偶聯(lián)以及阻止分子間和分子內(nèi)的相互作用，NT-2的QY顯著增加，約為NT-1的1.8倍。進一步擴展NT-1和NT-2，得到了發(fā)射波長紅移的探針(NT-3和NT-4)。結(jié)果表明，NT-1、NT-2、NT-3和NT-4具有高QY和大Stokes位移等優(yōu)異的光學(xué)性能。此外，與報道的NIR-II探針相比，這四種探針的另一個優(yōu)點是合成過程簡單，產(chǎn)率高達90%左右。隨后，本研究選擇NT-4進行修飾和制備納米顆粒(TPGS-NT-4 NPs)。體內(nèi)血管造影實驗顯示TPGS-NT-4 NPs在1300 LP下具有較高的分辨率和SBR，證明TPGS-NT-4 NPs具有高分辨率的NIR-II成像引導(dǎo)血管造影的能力。NT-1、NT-2、NT-3和NT-4不僅擴展了不對稱NIR-II探針的文庫，而且其簡單的合成和顯著的NIR-II成像特性也有利于它們的商業(yè)或臨床轉(zhuǎn)化。此外，TPGS-NT-4 NPs具有良好的光熱性能?；诰植窟f送和治療的優(yōu)勢，在808 nm激光照射下局部注射TPGS-NT-4 NPs并血管造影后，腫瘤縮小甚至消融。局部光熱療法聯(lián)合血管造影可以進一步增加腫瘤攝取，同時減少對正常組織的損傷。這些實驗結(jié)果進一步表明，TPGS-NT-4 NPs有望成為血管造影和局部光熱成像的有效藥物。

參考文獻

Li, L., Ma, X., Peng, Y., Yin, J., Guissi, N. E. I., & Wang, Y. (2023). Bright Asymmetric Shielding Strategy-Based NIR-II Probes for Angiography and Localized Photothermal Therapy. ACS Appl Bio Mater, 6(4), 1639-1649. 

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