百歐博偉生物：在液相色譜中，給你一個(gè)樣品，怎么來選擇流動(dòng)相將樣品分開呢？在什么情況下使用緩沖溶液呢？緩沖溶液的選擇有什么技術(shù)要求？

一、緩沖液的選擇當(dāng)分離酸性或堿性樣品時(shí)，通常需加入一定量的緩沖鹽，緩沖鹽的濃度及類型如何確定？

1、緩沖鹽的濃度緩沖鹽的濃度對(duì)離子樣品保留值的影響通常較小，濃度一般為10-50mmol/l。

2、緩沖鹽的類型緩沖鹽類型的選擇，主要取決于所需要的緩沖能力，在反向色譜中，流動(dòng)相中水相的pH和離子強(qiáng)度在開發(fā)對(duì)條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對(duì)于離子型化合物，典型的樣品的保留隨pH改變而明顯變化。

通常在pH2到4條件下，保留時(shí)間對(duì)pH的微小改變穩(wěn)定性。因此建議將這一pH范圍作為大多數(shù)樣品方法開發(fā)的起始pH，包括堿性化合物和一般的弱酸。緩沖鹽溶液的pH值越接近其pka，緩沖能力越強(qiáng)。一般緩沖鹽溶液的pH值應(yīng)在其pka±1的范圍內(nèi)。

3、緩沖鹽的離子締合如酸性條件下分離堿性化合物，加入NH4CL，堿性物質(zhì)離子與反離子相互作用的平衡導(dǎo)致它們相互的溶劑化并形成相關(guān)復(fù)合物離子：[堿]+[Cl]=[堿+Cl]，在低pH時(shí)，堿性化合物被完成質(zhì)子化，溶液陰離子（如Cl-）在流動(dòng)相中破壞了堿性物周圍的水分子并增加其疏水性，導(dǎo)致樣品保留時(shí)間增加，當(dāng)鹽濃度大于50mM時(shí)，保留時(shí)間略有下降，這可能是飽和反離子CI-引起的離子相互作用的屏蔽作用。此外還可以添加硫酸鈉或者高氯酸鈉等改變堿性化合物的保留。

4、緩沖鹽的其它性質(zhì)緩沖鹽的溶解性、揮發(fā)性和穩(wěn)定性（可能與設(shè)備、樣品和或色譜柱發(fā)生作用）對(duì)某些分離也很重要。如磷酸鹽，在含有高濃度有機(jī)相（70%以上），可能會(huì)析出；一些緩沖劑放置即降解，貯存或長期使用后其紫外吸收會(huì)增加（如：TFA、三乙胺）；一些緩沖鹽能通過形成離子對(duì)，對(duì)樣品發(fā)生作用（如三氟醋酸緩沖劑與陽離子樣品，三乙胺與陰離子樣品等）；揮發(fā)性的緩沖鹽如碳酸胺、甲酸銨、醋酸銨等可應(yīng)用于蒸發(fā)光散射、質(zhì)譜的檢測。

二、峰拖尾常見原因及應(yīng)對(duì)方法

1、HPLC體系中存在過大的死體積，導(dǎo)致一部分的分析物在這些空間里滯留過長的時(shí)間而表現(xiàn)為拖尾。這種拖尾是對(duì)于每一個(gè)色譜峰都存在的，因此當(dāng)出現(xiàn)每個(gè)色譜峰都拖尾時(shí)，有可能就是這個(gè)原因。以前就遇到過這個(gè)問題，儀器增加了一個(gè)模塊，死體積增加，峰又胖又拖尾。應(yīng)對(duì)方法：更換更短、內(nèi)徑更小的管路；檢查部件的連接是否緊密；檢查保護(hù)柱或者在線過濾器的安裝是否合適（這個(gè)尤為常見）；換到表現(xiàn)正常的儀器排查下是否是色譜柱的原因等。

2、在HPLC柱中存在兩種或以上的吸附位點(diǎn)，這兩個(gè)位點(diǎn)與分析物作用的非均一性。有的固定相表面存在大量低能量吸附位點(diǎn)，這種吸附位點(diǎn)與分析物的作用是非選擇性的，包括色散或者簡單的極性作用。有的固定相表面同時(shí)存在少量的高能吸附位點(diǎn)，這種吸附位點(diǎn)與分析物的作用是有選擇性或者特異性的，包括氫鍵作用、離子交換作用和螯合作用等，不同吸附位點(diǎn)作用力不同導(dǎo)致峰拖尾。應(yīng)對(duì)方法：通過改變流動(dòng)相條件（如添加劑，pH值等）或者針對(duì)性地更換色譜柱來減少拖尾。

3、色譜柱過載。當(dāng)樣品進(jìn)樣量過大，使色譜柱出現(xiàn)過載時(shí)，色譜峰也會(huì)表現(xiàn)出拖尾。特別是帶電荷的化合物時(shí)，當(dāng)保留在固定相上時(shí)會(huì)因?yàn)殪o電排斥而大大降低其載樣量。應(yīng)對(duì)方法：可以通過降低進(jìn)樣量觀察峰形是否改善來確定是否是過載導(dǎo)致的峰拖尾。對(duì)于由于帶電荷的化合物，可以通過調(diào)節(jié)pH值（比如把化合物調(diào)至中性狀態(tài)）或者加入離子對(duì)試劑來改善峰形。

4、色譜柱柱頭污染或篩板部分堵塞。這樣導(dǎo)致分析物分子中的一部分滯留時(shí)間增加從而導(dǎo)致拖尾。應(yīng)對(duì)方法：這種情況一般表現(xiàn)為色譜圖的所有色譜峰都出現(xiàn)拖尾，可以通過更換同款色譜柱來排查或者反接色譜柱（如果確定色譜柱可以反接）觀察峰形是否改善來判斷。

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