圖3. TPEBF NP、TPABF NP和OTTBF NP表征

然后，先使用生物相容性兩親性聚合物DSPE-PEG2000將疏水分子封裝成納米顆粒（NPs）（圖3a）。透射電子顯微鏡（TEM）分析表明，TPEBF NPs、TPABF NPs和OTTBF NPs表現(xiàn)出一致的球形形貌，直徑分別約為93 nm、102 nm和97 nm，小于動(dòng)態(tài)光散射（DLS）結(jié)果（133 nm、130 nm和128 nm）（圖3b）。值得注意的是，與 TPEBF NPs 和 TPABF NPs 相比，OTTBF NPs 在 1000–1400 nm 的 NIR-II 窗口范圍內(nèi)顯示出更寬的吸收，表明它是一種很有前途的在 NIR-II 區(qū)域?qū)崿F(xiàn)光熱抗腫瘤的 PTA分子（圖 3c）。盡管用于生物應(yīng)用的 1064 nm 的 MPE 為 1 W cm?2，采用較低的激光功率可增強(qiáng)生物樣品的相容性。本文采用了 0.7 W cm?2 的激光功率密度在1064 nm 處評估 NPs 的光熱效應(yīng)。如圖3d和圖3e所示，在1064 nm激光（0.70 W cm?2） 5 分鐘。相比之下，TPEBF NPs和TPABF NPs的溫度僅略有升高，分別為27.9 °C和36.4 °C。3種NPs的光熱效應(yīng)差異歸因于它們在NIR-II窗口中的不同吸收能力。OTTBF NPs在808 nm處的溫度增量比較（0.33 W cm?2為31.5 °C），50.5 °C 代表 0.70 W cm?2）和 1064 nm（54.8 °C 為 0.70 W cm?2）還表明，OTTBF NPs在NIR-II區(qū)域中的光熱轉(zhuǎn)換比在NIR-I區(qū)域中具有更好的光熱轉(zhuǎn)換（圖3f）。為了全面比較NIR-I和NIR-II激光器的深層組織光熱轉(zhuǎn)換能力，記錄了OTTBF NPs在被不同厚度的雞組織覆蓋后，再在相同功率密度（0.7 W cm?2）下以808 nm或1064 nm輻照5 分鐘后的溫度增量。圖3g所示的結(jié)果表明，無論覆蓋的組織厚度如何，照射1064 nm的OTTBF NPs的溫度增量都高于808 nm的溫度增量。此外，OTTBF NPs的溫度升高表現(xiàn)出激光功率密度和NPs濃度依賴性行為（圖3h和3i）。TPEBF NPs和TPABF NPs在808 nm（0.33 W cm?2）的輻照下也表現(xiàn)出相似的行為。TPEBF NPs、TPABF NPs和OTTBF NPs的光熱轉(zhuǎn)換效率（PCE，η）分別為22.5、37.3和54.1%（圖3j和S5）。通過記錄交替加熱和冷卻動(dòng)作過程中的溫度變化，進(jìn)一步研究了OTTBF NPs的光穩(wěn)定性。經(jīng)過五個(gè)循環(huán)后，OTTBF NPs的溫度變化可以忽略不計(jì)（圖3k）。通過檢測NPs的吸收強(qiáng)度，研究了NPs的光漂白性能和ROS抗性。在 808 nm 激光 （0.33 W cm?2） 或 1064 nm 激光器 （0.7 W cm?2），OTTBF NPs的吸收強(qiáng)度變化可以忽略不計(jì)。然而，在相同條件下，吲哚菁綠（ICG）和ICG NPs的吸收強(qiáng)度急劇下降（圖3l）。OTTBF NPs和ICG的比較圖也顯示在圖3n中。在存在各種ROS的情況下，例如次氯酸鹽（ClO?）、叔丁基過氧自由基（TBO?）和羥基自由基（?OH）在濃度為200μM時(shí)，ICG的吸收強(qiáng)度比其原始值下降約95%（圖3m）。然而，在相同條件下，OTTBF NPs的吸收強(qiáng)度保持不變。TPEBF NPs和TPABF NPs也表現(xiàn)出與OTTBF NPs一樣相對較高的化學(xué)和光穩(wěn)定性。此外，三種NPs在不同pH值的溶液中表現(xiàn)出高穩(wěn)定性。這些結(jié)果表明了BF2BAD 受體集成的小型有機(jī) PTA 具有高穩(wěn)定性和，OTTBF NPs 具有出色的光熱轉(zhuǎn)換能力，使其非常適合生物 PTT 應(yīng)用。

圖4. TPEBF、TPABF和OTTBF的理論計(jì)算

為了更深入地了解TPEBF、TPABF和OTTBF之間光物理特性的差異，使用密度泛函理論（DFT）和含時(shí)DFT（TD-DFT）計(jì)算進(jìn)行了全面的理論研究。在M06-2X-D3/6-31G（d）水平上，使用DFT方法對三個(gè)分子的基態(tài)幾何結(jié)構(gòu)進(jìn)行了全面優(yōu)化。在基態(tài)，三個(gè)分子的LUMO主要位于二氟化硼橋聯(lián)的氮雜富烯二聚體受體基團(tuán)的中心核上，而HOMO在整個(gè)共軛骨架中基本上是離域的（圖4a）。OTTBF（3.00eV）中HOMO和LUMO之間的能隙比TPEBF（3.52eV）和TPABF（3.25eV）中的能隙窄，導(dǎo)致吸收波長發(fā)生紅移。此外，還計(jì)算了垂直激發(fā)下TPEBF、TPABF和OTTBF碎片（受體核心和其他部分）之間的電荷轉(zhuǎn)移量。圖4b顯示的結(jié)果表明，與TPEBF（0.41887 e）和TPABF（0.50787 e）相比，OTTBF具有的電荷轉(zhuǎn)移量（0.55751 e），導(dǎo)致的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）效應(yīng)。這與OTTBF觀察到的最長吸收波長一致。無論是在基態(tài)還是激發(fā)態(tài)，在OTTBF中噻吩和相鄰苯環(huán)之間的二面角是三個(gè)分子中最小的。OTTBF的相對平面幾何形狀解釋了上述吸收光譜實(shí)驗(yàn)中觀察到的較高M(jìn)EC值。

然后計(jì)算三個(gè)分子的重組能（λ），以定量評估它們在光激發(fā)下的幾何弛豫程度，即分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)。還提供了鍵長、鍵角和二面角對總λ的貢獻(xiàn)（圖4c-e）。TPEBF、TPABF和OTTBF的總λ分別計(jì)算為1772 cm-1、1792 cm-1和1978 cm-1。在這些分子中，OTTBF的總λ，表示分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)。值得注意的是，低頻區(qū)的法向模是由二面角的變化引起的，與非輻射衰變密切相關(guān)。二面角變化對OTTBF總λ的貢獻(xiàn)（30.35%）明顯高于TPEBF（17.45%）和TPABF（18.72%），表明OTTBF在光激發(fā)下經(jīng)歷了更強(qiáng)的非輻射弛豫。總的來說，這些理論計(jì)算為TPEBF、TPABF和TPE-BFF之間的光物理性質(zhì)差異提供了合理的解釋。

圖5. OTTBF NPs 體外實(shí)驗(yàn)

受到OTTBF NPs出色光熱性能的鼓舞，本文隨后評估了其對4T1和MCF-7細(xì)胞的PTT體外療效。首先，采用MTT法研究了OTTBF NPs的暗細(xì)胞毒性。如圖5a和5b所示，在與不同濃度的OTTBF NP（0-20μg/mL）孵育24小時(shí)后，細(xì)胞存活率的降低可以忽略不計(jì)，表明具有良好的生物相容性。然而，在1064 nm（0.70 W cm?2）下暴露7分鐘后，OTTBF NPs表現(xiàn)出濃度依賴性的光毒性，與20μg/mL OTTBF NPs一起孵育時(shí)，細(xì)胞存活率顯著降至11%。然后，比較了OTTBF NPs在NIR-I和NIR-II窗口下的細(xì)胞毒性。圖5c顯示的結(jié)果顯示，即使在相同的功率密度下，1064 nm激光治療組在所有濃度范圍內(nèi)也表現(xiàn)出比808 nm治療組更高的光毒性。還進(jìn)行了深層癌癥細(xì)胞的光熱治療實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證NIR-II激活的PTT的優(yōu)勢（圖2d和5d）。盡管通過以不同厚度覆蓋96孔板上的雞組織，OTTBF NPs的光毒性相應(yīng)降低，但在相同條件下，1064 nm激光治療組的細(xì)胞存活率低于808 nm組。這與解決方案中的結(jié)果一致（圖3g），表明NIR-II中的PTT確實(shí)比NIR-I區(qū)域中的PTT更適合治療深層癌癥。

通過使用鈣黃綠素AM和碘化丙啶（PI）的共染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了OTTBF NPs的光療功效，其中綠色和紅色熒光信號分別對應(yīng)于活細(xì)胞和死細(xì)胞。如圖5e所示，在PBS和OTTBF NPs組中可以觀察到明顯的綠色熒光信號，表明在這些實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞毒性可以忽略不計(jì)。然而，OTTBF NPs+1064nm組同時(shí)顯示綠色和紅色熒光，紅色信號比808nm處理組更強(qiáng)。同時(shí)用商業(yè)溶酶體染料（Lyso Tracker Green）和負(fù)載Cy5染料的OTTBF NPs處理4T1細(xì)胞，以研究NPs的共定位（圖5f）。Lyso Tracker的綠色通道與紅色通道表現(xiàn)出很強(qiáng)的相關(guān)性（重疊系數(shù)為0.80），表明OTTBF NPs通過溶酶體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑內(nèi)化到4T1細(xì)胞中。據(jù)報(bào)道，PDT或PTT可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞器降解并引發(fā)細(xì)胞死亡。為了研究OTTBF NPs介導(dǎo)的潛在溶酶體破壞，本文進(jìn)行了吖啶橙（AO）染色生物成像。通常，AO在完整的溶酶體中以質(zhì)子化低聚物的形式發(fā)出紅色熒光，而在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，它以單體去質(zhì)子化的形式發(fā)出綠色信號。如圖5g所示，由于完整的溶酶體，在PBS和OTTBF NPs組中觀察到亮紅色熒光信號。然而，當(dāng)暴露于功率密度為0.70 W cm?2的808 nm或1064 nm照射下時(shí)，AO信號的消失表明溶酶體的完整性受到嚴(yán)重破壞。通過AV-FITC/PI染色進(jìn)一步研究了OTTBF NPs光熱處理誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑（圖5h）。用OTTBF NPs和光（808 nm或1064 nm）處理的4T1細(xì)胞顯示出比PBS和OTTBF NPs組更強(qiáng)的綠色和紅色熒光信號，表明處理組中出現(xiàn)了更多的細(xì)胞凋亡或壞死。

圖6. 載Cy7的OTTBF NPs（1 mg/mL，100μL）荷瘤小鼠的時(shí)間依賴性NIR-II熒光成像

受OTTBF NPs優(yōu)異的體外光熱性能的啟發(fā)，研究了體內(nèi)光子熱療抗腫瘤。由于OTTBF NPs的熒光強(qiáng)度相對較低，Cy7染料被共包封在NP中。首先，本文通過靜脈注射在荷瘤小鼠體內(nèi)評估了OTTBF NPs在4T1中的體內(nèi)腫瘤積聚和生物分布。如圖6a和6b所示，給藥6小時(shí)后，在腫瘤部位觀察到明顯的NIR-II熒光信號，約36小時(shí)后信號達(dá)到強(qiáng)度，表明OTTBF NPs具有顯著的腫瘤積聚能力。同時(shí)，主要器官和腫瘤的離體成像進(jìn)一步證實(shí)了OTTBF NPs在腫瘤中的有效攝取和保留（圖6c和6d）。

圖7. OTTBF NPs對荷瘤小鼠進(jìn)行NIR-II PPT治療