本文要點(diǎn)：在近紅外二區(qū)（NIR-II，1000-3000 nm）發(fā)射的熒光染料為血管和淋巴系統(tǒng)的實(shí)時(shí)和高分辨率成像提供了重大進(jìn)展。然而，在體內(nèi)NIR-II追蹤標(biāo)記細(xì)胞的課題仍然具有挑戰(zhàn)性。在這里，我們開發(fā)了一種屏蔽單元-供體-受體-供體-屏蔽單元（S-D-A-D-S）NIR-II熒光團(tuán)（FE-4ZW），帶有兩性離子末端基團(tuán)，用于高效細(xì)胞標(biāo)記，而無需使用細(xì)胞穿透肽，從而增強(qiáng)了細(xì)胞遷移位置的非侵入性體內(nèi)測(cè)定。拴系末端磺基銨內(nèi)鹽具有對(duì)細(xì)胞膜的高親和力，因此即使對(duì)于固定細(xì)胞也能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的標(biāo)記。移植干細(xì)胞的命運(yùn)和腫瘤細(xì)胞在腦或外周組織中沿淋巴系統(tǒng)的遷移由細(xì)胞內(nèi)化的FE-4ZW清楚地監(jiān)測(cè)。本文還證實(shí)，臨床使用的表面活性劑D-α-生育酚聚乙二醇-1000琥珀酸酯可以減少肝臟和脾臟對(duì)FE-4ZW的攝取。本文報(bào)道的熒光團(tuán)設(shè)計(jì)策略和細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)為細(xì)胞遷移的可視化和對(duì)重新定位過程的洞察開辟了一個(gè)新的領(lǐng)域，從而最終為更詳細(xì)地研究干細(xì)胞治療和腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制提供了機(jī)會(huì)。

動(dòng)物活體成像

方案1. FE-4ZW作為細(xì)胞示蹤劑的制造和體內(nèi)跟蹤血液循環(huán)和淋巴系統(tǒng)中細(xì)胞遷移的圖示

本文研究了FE-4ZW和FE-2PEG在單獨(dú)靜脈給藥后的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。與循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)且具有部分腎排泄特征的FE-2PEG相比，F(xiàn)E-4ZW在短血循環(huán)時(shí)間（～50分鐘）內(nèi)在肝臟和脾臟中積累更快。隨后，肝臟和脾臟中的熒光信號(hào)強(qiáng)度隨著時(shí)間的推移而增加，逐漸降低（圖1A-C和S13）?；贔E-4ZW與FE-2PEG相比更快的肝臟攝取特征，我們假設(shè)當(dāng)FE-4ZW注射到小鼠的血液循環(huán)系統(tǒng)中時(shí)，它們也被肝細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞（Kupffer細(xì)胞）內(nèi)吞。這種發(fā)現(xiàn)的差異初步表明，與FE-2PEG相比，F(xiàn)E-4ZW具有更快的積累速率，從而表明FE-4ZW可能與細(xì)胞膜具有更強(qiáng)的相互作用，因此有可能作為更好的細(xì)胞造影劑。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了廣泛的體外和/或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來測(cè)量FE-4ZW作為細(xì)胞造影劑的能力。

圖1. FE熒光團(tuán)提供有效的第二近紅外（NIR-II）熒光成像對(duì)比度水平的能力

由于FE-4ZW與細(xì)胞膜之間存在潛在的相互作用和/或親和力，我們的方案不要求使用CPP，因此在獲得熒光細(xì)胞方面更加簡(jiǎn)化和直接（圖1D-F）。利用幾種類型的細(xì)胞系，包括肝臟、巨噬細(xì)胞、干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞來評(píng)估 FE 熒光團(tuán)系列。在FE-4ZW與不同細(xì)胞系共孵育的整個(gè)過程中，F(xiàn)E-4ZW標(biāo)記細(xì)胞的NIR-II熒光強(qiáng)度隨時(shí)間增加，其中在12小時(shí)時(shí)間點(diǎn)有足夠的標(biāo)記密度允許明亮的NIR-II成像（圖1F和S5）。對(duì)于所有測(cè)試的細(xì)胞系，F(xiàn)E-4ZW的明亮NIR-II熒光信號(hào)允許在內(nèi)化時(shí)明確地勾勒出細(xì)胞形狀（圖1E，F(xiàn)和S5）。

圖2. FE-4ZW作為一種高性能細(xì)胞標(biāo)記染料

相比之下，在 L-O2 細(xì)胞組中，當(dāng)它們與 FE-2PEG 或 FE-2PEG2ZW 熒光團(tuán)一起孵育時(shí)，獲得了非常低的熒光強(qiáng)度。這些結(jié)果表明，分子結(jié)構(gòu)在作為高效細(xì)胞標(biāo)記生物技術(shù)的作用中起著重要作用（圖2A，B）。FE-4ZW的細(xì)胞內(nèi)光穩(wěn)定性也是通過將標(biāo)記的L-O2細(xì)胞置于連續(xù)激光照射下來確定的（圖2C）。熒光信號(hào)僅在2小時(shí)的時(shí)間過程中以極慢的速率衰減?？偟膩碚f，F(xiàn)E-4ZW是一種理想的細(xì)胞成像劑，具有明亮的細(xì)胞內(nèi)NIR-II熒光發(fā)射和優(yōu)異的光穩(wěn)定性。FE-4ZW為非侵入性跟蹤體內(nèi)細(xì)胞命運(yùn)奠定了基礎(chǔ)。

在細(xì)胞中使用FE-4ZW孵育12小時(shí)后，用新鮮培養(yǎng)基替換含有未內(nèi)化FE-4ZW的細(xì)胞培養(yǎng)基。將標(biāo)記的細(xì)胞順序培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá) 7 天，每天收集上清液并通過 NIR-II 檢測(cè)器成像。所有收集的上清液均未觀察到可檢測(cè)到的 NIR-II 信號(hào)，而細(xì)胞本身表現(xiàn)出明亮的 NIR-II 熒光信號(hào)，這表明標(biāo)記細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi) FE-4ZW 染料的穩(wěn)定內(nèi)化（圖 2E、F）。另一個(gè)補(bǔ)充需求是體內(nèi)細(xì)胞追蹤，即使在主要標(biāo)記信號(hào)顯示細(xì)胞增殖過程中耗盡后，也能充分檢測(cè)增殖的細(xì)胞。即使細(xì)胞計(jì)數(shù)呈指數(shù)增長(zhǎng)（經(jīng)CCK8測(cè)定證實(shí)），穩(wěn)定的NIR-II熒光信號(hào)仍可檢測(cè)到長(zhǎng)達(dá)6天（圖2G-I）。上述結(jié)果表明，F(xiàn)E-4ZW在細(xì)胞中的標(biāo)記和/或內(nèi)化可以維持很長(zhǎng)時(shí)間，從而為利用高對(duì)比度NIR-II熒光生物成像在細(xì)胞水平上監(jiān)測(cè)復(fù)雜的生理過程提供了機(jī)會(huì)。

圖3. 通過使用 FE-4ZW 進(jìn)行第二次近紅外 （NIR-II） 熒光成像來跟蹤移植神經(jīng)干細(xì)胞 （NSC） 的位置

通過用 FE-4ZW 預(yù)培養(yǎng) NSC 來證明活體 NSC 跟蹤，然后靜脈注射標(biāo)記的 NSC。根據(jù)既定方案，通過離心仔細(xì)收集FE-4ZW標(biāo)記的發(fā)光NSC，隨后靜脈內(nèi)移植到Balb / C小鼠模型的血液循環(huán)系統(tǒng)中（圖3A）。NIR-II熒光信號(hào)在立即觀察時(shí)提供了清晰的肺部輪廓，從而揭示了標(biāo)記的NSC首先在肺部積聚。這一結(jié)果與之前關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞監(jiān)測(cè)的報(bào)道一致。肺內(nèi)FE-4ZW標(biāo)記的NSC的NIR-II熒光信號(hào)隨著時(shí)間的推移逐漸減少，并在72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)后幾乎消失。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，肝臟中的NIR-II熒光信號(hào)逐漸增加。這些結(jié)果證實(shí)，靜脈注射后移植的NSC在肺部初始積累后逐漸轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟（圖3B-E）。通過跟蹤NSCs進(jìn)行縱向?qū)崟r(shí)體內(nèi)成像，可為臨床NSC治療的生理機(jī)制和障礙的檢測(cè)提供便捷的細(xì)胞跟蹤技術(shù)。

監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的命運(yùn)對(duì)于研究潛在的腫瘤轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，但目前的非侵入性策略未能實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。皮內(nèi)注射FE-4ZW標(biāo)記的4T1腫瘤細(xì)胞，并觀察到腫瘤細(xì)胞（或細(xì)胞聚集簇）隨著時(shí)間的推移沿著淋巴管遷移（圖3F），從而最終接種在相鄰的淋巴結(jié)中（圖3G，H）。通過體外泄漏實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)來測(cè)試FE-4ZW的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在細(xì)胞內(nèi)化后，F(xiàn)E-4ZW可以穩(wěn)定地存在于細(xì)胞區(qū)室中（圖2D-I）。此外，體內(nèi)NSC細(xì)胞追蹤結(jié)果顯示，F(xiàn)E-4ZW標(biāo)記的NSCs在肺內(nèi)停留了很長(zhǎng)時(shí)間，并逐漸循環(huán)到肝臟。這表明內(nèi)部化的FE-4ZW沒有與NSC分離。如果FE-4ZW從細(xì)胞中分離出來，肺的輪廓將迅速消失（圖3B，D）。圖3F中沿淋巴管自由移動(dòng)的熒光點(diǎn)的存在表明細(xì)胞聚集簇沿著淋巴管運(yùn)輸，而不是FE-4ZW染料自由移動(dòng)。本文報(bào)道的方法可能適用于監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞的命運(yùn)和遷移途徑，從而可以識(shí)別腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵參數(shù)。