圖3. PTT -CDT體外細(xì)胞殺傷及 ICD 指標(biāo)的表達(dá)

如圖 3D所示，與其他制劑相比，用 mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2+ L處理的 143b 和 b 細(xì)胞?介導(dǎo)了 CRT，這與細(xì)胞內(nèi) ROS 擴(kuò)增結(jié)果一致。此外，該組中還顯示出 HMGB1 信號(hào)減弱，CRT 水平的這種相反趨勢(shì)進(jìn)一步證明了我們的納米平臺(tái)增強(qiáng)的 ICD 效應(yīng)（圖 3D）。隨后，為了進(jìn)一步說明 ICD 相關(guān)蛋白的表達(dá)，通過蛋白質(zhì)印跡分析研究了各種處理后 143b 中的 CRT 和 HMGB1 水平。顯然，當(dāng)用 mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2 + L 處理 143b 細(xì)胞時(shí)，CRT 在細(xì)胞膜上顯著上調(diào)，而 HMGB1 在細(xì)胞質(zhì)中顯著下調(diào)?（圖 3E 、F）。與mCu&Ce@ICG/RGD 組相比，mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2+ L中上述表達(dá)的蛋白質(zhì)水平分別大約高出 2 倍和降低 5 倍?（圖 3I、J），揭示了該處理強(qiáng)大的 ICD激發(fā)能力。最后，分別用CLSM和流式細(xì)胞儀獲得活死染色圖像和細(xì)胞凋亡-壞死研究。與細(xì)胞內(nèi)ROS生成和HMGB1的結(jié)果類似，143b細(xì)胞在mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2+ L中經(jīng)歷細(xì)胞死亡?（圖 3K -N）。正如預(yù)期的那樣，當(dāng)mCu&Ce@ICG/RGD的濃度增加到300µg / mL時(shí)，H2O2預(yù)孵育加激光照射組中143b細(xì)胞的細(xì)胞活力僅為純納米平臺(tái)處理組的一半。這種腫瘤細(xì)胞殺傷力主要由PTT同時(shí)擴(kuò)增的ROS和ICD介導(dǎo)。

圖4. 通過熒光成像、MRI 和光熱評(píng)估進(jìn)行體內(nèi)腫瘤靶向性評(píng)估

之后，研究mCu&Ce@ICG/RGD在骨肉瘤荷瘤裸鼠模型中的生物分布和腫瘤富集行為。首先，為了獲得準(zhǔn)確的腫瘤輪廓辨別，將mCu@ICG/RGD和mCu&Ce@ICG/RGD分別靜脈注射到荷瘤小鼠皮下，隨后在特定時(shí)間拍攝NIR-II熒光生物圖像，通過小動(dòng)物NIR-II熒光成像生物系統(tǒng)監(jiān)測(cè)該納米平臺(tái)在體內(nèi)的腫瘤靶向性和生物分布。顯然，在注射mCu&Ce@ICG/RGD后2 h，腫瘤輪廓逐漸清晰，熒光信號(hào)（超過1000 nm）最初集中在腫瘤部位，腫瘤輪廓與周圍外周肌肉組織明顯區(qū)分開來；隨后，它隨著時(shí)間的推移而緩慢衰減，殘留納米平臺(tái)保持在48小時(shí)（圖 4 A）。而mCu@ICG/RGD的熒光信號(hào)主要分散在肝臟中，并且在所有時(shí)間間隔內(nèi)都明顯高于mCu&Ce@ICG/RGD組?；谠诟闻K中的這種高積累，后一組的腫瘤組織幾乎無法區(qū)分（圖 4 A）。同時(shí)，收獲腫瘤和主要器官進(jìn)行離體NIR-II熒光生物成像。值得注意的是，即使可以看到上述兩組腫瘤中的比較光信號(hào)強(qiáng)度，mCu&Ce@ICG/RGD處理的肝臟的強(qiáng)度明顯低于mCu@ICG/RGD（圖 4 B）。此處，前者相對(duì)快速的生物降解行為有利于肝臟清除。因此，腫瘤與周圍正常組織的比例通過半定量平均NIR-II信號(hào)強(qiáng)度來計(jì)算。mCu&Ce@ICG/RGD 在注射后 24 小時(shí)的數(shù)值比 mCu@ICG/RGD 高 6 倍（圖 4D）。此外，本文還通過MRI 驗(yàn)證了Cu 基納米平臺(tái)對(duì)腫瘤的特異性識(shí)別，以臨床Gd-DTPA 為對(duì)照。根據(jù)不同時(shí)間間隔的連續(xù) T1WI MRI 生物圖像，足底注射 mCu&Ce@ICG/RGD 的淋巴轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的 MRI 信號(hào)在注射后 24 小時(shí)急劇增加至峰值水平，從此時(shí)間點(diǎn)開始逐漸衰減至基礎(chǔ)強(qiáng)度（圖 4C）。然而，由于 Gd-DTPA 的快速排泄，可以在注射后 2 小時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤積累。我們的納米平臺(tái)在 24 小時(shí)的腫瘤與組織比明顯高于 Gd-DTPA（圖 4E），進(jìn)一步證明了mCu&Ce@ICG/RGD有效的腫瘤靶向能力，此時(shí)最合適進(jìn)行激光照射進(jìn)行PTT。最后，研究了皮下骨肉瘤小鼠尾靜脈注射PBS、mCu&Ce@ICG和mCu&Ce@ICG/RGD后在體內(nèi)的光熱轉(zhuǎn)換效果。具體而言，納米制劑處理的腫瘤部位溫度急劇變化，升高到峰值（分別為48.9和52.8°C），并且光熱維持率（圖 4F，G）。毫無疑問，這種現(xiàn)象主要?dú)w因于RGD修飾的主動(dòng)靶向能力。對(duì)于PBS處理的小鼠，即使經(jīng)過300秒的照射，溫度也僅略有升高（39.8°C）（圖 4F，G）。因此，上述體內(nèi)生物成像結(jié)果凸顯了多模對(duì)比納米劑在腫瘤診斷方面的潛力和令人滿意的腫瘤抑制熱療性能。

圖5.  體內(nèi) PTT CDT 和 ICD 評(píng)估

參考文獻(xiàn)

heng, M., Kong, Q., Tian, Q. et al. Osteosarcoma-targeted Cu and Ce based oxide nanoplatform for NIR-II fluorescence/magnetic resonance dual-mode imaging and ros cascade amplification along with immunotherapy. J Nanobiotechnol 22, 151 (2024).