本文要點(diǎn)：多重?zé)晒獬上裰饕獞?yīng)用于細(xì)胞成像，NIR區(qū)域的多色熒光成像能夠可視化體內(nèi)的各種生物過程，適用于機(jī)制研究、疾病診斷和成像引導(dǎo)手術(shù)，可提供體外成像無法獲得的信息。傳統(tǒng)上，多重?zé)晒獬上窨梢酝ㄟ^使用共同激發(fā)波長(zhǎng)、不同檢測(cè)通道，然后進(jìn)行光譜分解來完成。然而，由于NIR區(qū)域的分辨率和對(duì)比度各異，每個(gè)檢測(cè)通道的分辨率將有顯著差異。可以通過多路復(fù)用激發(fā)和單通道檢測(cè)以避免該問題，使所有窗口具有一致的分辨率和對(duì)比度。為了實(shí)現(xiàn)多路復(fù)用成像，非常需要具有良好間隔的吸收和發(fā)射光譜的NIR-II熒光探針相互匹配，可以用單獨(dú)的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)并在相同的NIR-II發(fā)射波長(zhǎng)中檢測(cè)。近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)MARS

目前，大多數(shù)近紅外熒光探針具有較小的斯托克斯位移、突出的自猝滅特性，并且傾向于流出細(xì)胞，不利于體內(nèi)高對(duì)比度的細(xì)胞跟蹤。因此，迫切需要開發(fā)具有長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)、大斯托克斯位移、優(yōu)異的抗猝滅能力且在細(xì)胞中停留時(shí)間長(zhǎng)的近紅外熒光團(tuán)。

鑒于此，本研究開發(fā)了兩種菁染料：FNIR-1090和IR-765，其中FNIR用于標(biāo)記癌癥細(xì)胞，在近紅外II區(qū)（NIR-II）進(jìn)行多路激發(fā)和單通道檢測(cè)，用于體內(nèi)雙色成像（方案1）。

方案1. 雙色體內(nèi)熒光成像和使用FNIR-1090標(biāo)記癌癥細(xì)胞

FNIR-1090是在Pr-1099衍生物上通過SRN1置換反應(yīng)與1-乙基pai嗪連接而構(gòu)建的，在連續(xù)808nm激光照射下顯示出優(yōu)異的量子產(chǎn)率（0.074%）和令人滿意的光穩(wěn)定性。IR-765是通過Vilsmeier-Haack試劑與2-（3,5,5-三甲基環(huán)己-2-亞苯基）丙二腈（TEMO）的一步反應(yīng)合成的，在連續(xù)660nm激光照射下具有高效的光穩(wěn)定性、良好的生物相容性、高量子產(chǎn)率（6.7%）和優(yōu)異的抗光漂白性能。盡管IR-765發(fā)射max值不在NIR-II區(qū)域，但好的熒光亮度使其熒光發(fā)射尾部在NIR-II成像系統(tǒng)中很容易被檢測(cè)到。

圖1. FNIR-1090（a）和IR-765（b）的吸收與發(fā)射光譜

使用NIR-II成像系統(tǒng)研究?jī)煞N探針在不同介質(zhì)（DMSO，4%吐溫-20/PBS，1×PBS緩沖液和4T1細(xì)胞懸浮液）中的串?dāng)_。發(fā)現(xiàn)FNIR-1090和IR-765在不同介質(zhì)中都保持了明顯的熒光信號(hào)，不會(huì)相互干擾。

圖2. FNIR-1090和IR-765在不同介質(zhì)中的串?dāng)_

在含10% FBS的PBS溶液中，IR-765和FNIR-1090分別在660nm和808nm激光連續(xù)照射1小時(shí)后，相對(duì)熒光強(qiáng)度沒有明顯變化，表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性。在37℃孵育下，F(xiàn)NIR-1090的相對(duì)熒光強(qiáng)度相當(dāng)穩(wěn)定。而IR-765的熒光信號(hào)在3小時(shí)后達(dá)到max值，然后保持相對(duì)恒定，可能是由于IR-765和FBS蛋白內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)域結(jié)合，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增高。

圖3. FNIR-1090和IR-765的光穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性

將IR-765腹腔注射到小鼠體內(nèi)，然后將FNIR-1090標(biāo)記的4T1細(xì)胞靜脈注射到小鼠體內(nèi)，用于體內(nèi)雙色成像。如圖4，探針分布清晰可見，IR-765和FNIR-1090的信噪比分別約為3.5和2.6，光學(xué)串?dāng)_可以忽略不計(jì)。IR-765和FNIR-1090顯示出優(yōu)異的體內(nèi)雙色NIR-II成像能力，高對(duì)比度雙通道成像可以對(duì)不同的組織進(jìn)行清晰的區(qū)分，促進(jìn)對(duì)深層組織進(jìn)一步的探索，以獲得多路信息。

圖4. 小鼠體內(nèi)多重?zé)晒獬上?/span>

總之，本研究設(shè)計(jì)并合成了兩種新型菁基熒光探針（FNIR-1090、IR-765），用于體內(nèi)實(shí)時(shí)雙色近紅外成像。兩種探針吸收光譜幾乎分離，熒光串?dāng)_可忽略不計(jì)，且表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、大斯托克斯位移，以及良好的組織穿透能力和高分辨率，是可用于生物醫(yī)學(xué)開發(fā)的優(yōu)質(zhì)NIR-II區(qū)熒光染料。

參考文獻(xiàn)

Huixian Jia, Yujie Liu, Wei Tang, Chenghui Liu, Xinrui Duan, Near-infrared fluorescent probes for non-invasive, real-time, and dual-color in vivo NIR-II imaging, Sensors and Actuators B: Chemical. 396 (2023) 134595.

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近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

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高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機(jī)，活體穿透深度高于15mm

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