研究內(nèi)容：近紅外二區(qū)（NIR-II）窗口的熒光成像在研究血管結(jié)構(gòu)和血管生成方面引起了人們的極大興趣，為早期疾病的精確診斷提供了有價值的信息。然而，由于熒光團的強光子散射和低熒光亮度，對深層組織中的小血管成像仍然具有挑戰(zhàn)性。本文描述了作者在熒光探針設計和圖像算法開發(fā)方面的共同努力。首先，使用聚合物共混策略來調(diào)節(jié)大型剛性NIR-II半導體聚合物的鏈堆積行為，以產(chǎn)生緊湊明亮的聚合物點（Pdots），這是小血管體內(nèi)熒光成像的先決條件。進一步開發(fā)了一種穩(wěn)健的Hessian矩陣方法來增強血管結(jié)構(gòu)的圖像對比度，特別是小血管和弱熒光血管。與原始圖像相比，在全身小鼠成像中獲得的增強的血管圖像在信噪比（SBR）方面表現(xiàn)出超過一個數(shù)量級的改善。利用明亮的Pdots和Hessian矩陣方法，作者最終進行了顱骨NIR-II熒光成像，并在攜帶腦腫瘤的小鼠和大鼠模型中獲得了高對比度的腦血管系統(tǒng)。Pdots探針開發(fā)和成像算法增強的研究為深層組織的NIR-II熒光血管成像提供了一種很有前景的方法。

圖1.（a）NIR-II半導體聚合物的分子結(jié)構(gòu)。（b）由純NIR-II半導體聚合物制備的聚集體或線狀聚合物納米結(jié)構(gòu)的TEM圖像。（c）通過將短剛性半導體聚合物與NIR-II半導體聚合物共混得到小球形Pdots的TEM圖像。

首先，作者研究了由兩組氟取代的半導體聚合物制備的NIR-II Pdots的大小和形態(tài)，單純的NIR-II聚合物納米顆粒是通過再沉淀法制備的，透射電子顯微鏡(TEM)觀察納米粒子呈現(xiàn)大尺寸和線狀形態(tài)。通過混合NIR-II聚合物和CN-PPV獲得的Pdots的大小和形態(tài)發(fā)生了顯著變化。從TEM圖像可以看出，所有六種類型的混合Pdots均表現(xiàn)出小尺寸和球形形態(tài)，與純CN-PPV Pdots相似。CN- PPV聚合物在Pdots形成過程中具有協(xié)同效應，迫使大的剛性聚合物主鏈折疊并扭曲NIR-II聚合物的鏈堆積，從而形成小尺寸的球形形態(tài)。這表明混合具有小共軛長度的傳統(tǒng)半導體聚合物是制備小尺寸球形NIR-II Pdots的可靠策略。

實驗證實，只有共軛聚合物，才能有效調(diào)節(jié)NIR-II半導體聚合物的鏈堆積行為，產(chǎn)生小球形的Pdots。作者研究了不同質(zhì)量分數(shù)的NIR-II聚合物m-PBTQ4F分別與PSMA、PS-PEG-COOH和CN-PPV共混制得的納米粒子的形態(tài)變化。對于PSMA和PS-PEG-COOH，所得到的大多數(shù)納米顆粒都呈短絲狀形態(tài)。雖然通過共混(1：1比例)可以減小粒子的尺寸，但粒子的尺寸分布很大，在透射電子顯微鏡中仍觀察到部分橢圓形的納米粒子。相反，當m-PBTQ4F與CN-PPV混合時，隨著CN-PPV分數(shù)的增加，觀察到了向單分散球形Pdots的明顯形態(tài)演變。這些結(jié)果表明，共混剛性共軛聚合物可以有效調(diào)節(jié)NIR-II半導體聚合物的鏈堆積，得到致密的球形Pdots，而柔性兩親聚合物沒有類似的效果。

圖3. (a)聚乙二醇化CN-PPV Pdots、m-PBTQ4F Pdots和 (b) 聚乙二醇化m-PBTQ4F/CN-PPV混合Pdots的吸收和發(fā)射光譜。(c)聚乙二醇化m-PBTQ4F/CN-PPV Pdots的流體動力學直徑和TEM圖像。(d)在808 nm連續(xù)輻射下ICG和Pdots在相同質(zhì)量濃度的水中的光穩(wěn)定性。

為了使Pdots具有更長的血液循環(huán)時間，將m-PBTQ4F和CN-PPV聚合物組成的小尺寸Pdots進一步用兩親性PS-PEG-COOH官能化。觀察三種類型Pdots的吸收和發(fā)射光譜，發(fā)現(xiàn)混合Pdots的吸收光譜與純m-PBTQ4F和CN-PPV Pdots的吸收光譜一致。此外，混合的Pdots在可見光和NIR-II區(qū)域顯示出雙發(fā)射峰。動態(tài)光散射(DLS)測量和TEM結(jié)果顯示，混合的Pdots呈球形，流體動力學直徑約為20 nm。以臨床批準的染料ICG為對照，對Pdots的光穩(wěn)定性進行了表征，在808 nm激光持續(xù)照射2 h下，Pdots的熒光保持接近原始強度的88%，而ICG在10 min內(nèi)光漂白，表明Pdots具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性。與不同濃度的Pdots孵育24小時后的細胞存活率測定顯示，Pdots的細胞毒性最小，靜態(tài)溶血試驗結(jié)果顯示，Pdots的溶血活性可忽略不計。此外，在注射Pdots的小鼠的主要器官的蘇木精和伊紅(H&E)染色圖像中未觀察到明顯異常?？傊?，這些結(jié)果表明聚乙二醇化m-PBTQ4F/CN-PPV Pdots是具有高亮度、光穩(wěn)定性和生物相容性的小尺寸探針，有望用于體內(nèi)成像應用。

首*行預處理以抑制圖像中的背景信號并增強血管的幾何特征。進一步估計一系列的尺度因子，構(gòu)造了平滑的高斯核，然后與圖像進行卷積，得到Hessian矩陣的元素。然后，考慮管狀結(jié)構(gòu)的具體情況，推導出Hessian矩陣的特征值，最終得到血管增強圖像。

作者通過使用Pdots探針和Hessian矩陣方法展示了活小鼠的高對比度全身血管成像。。在靜脈注射Pdots探針的小鼠的NIR-II熒光圖像中，雖然注射的Pdots屬于最亮的熒光團，但原始圖像中幾乎無法將熒光信號較弱的小血管與周圍背景區(qū)分開，經(jīng)Hessian矩陣法處理后，原始圖像中的許多小直徑血管和模糊血管均得到明顯增強。從仰臥位的同一只小鼠的原始圖像和增強圖像中，血管結(jié)構(gòu)明顯增強，而來自肝臟的信號受到抑制，因為該方法只能提取具有管狀結(jié)構(gòu)的目標。圖像處理后兩條小血管的SBR較原圖像增強了約13倍，說明Hessian矩陣算法對于提高全身熒光血管成像中弱小熒光血管的SBR有很強的效果。

圖5. 顱骨和頭皮完整的小鼠的腦脈管系統(tǒng)的體內(nèi)NIR-II熒光圖像。(a)野生型C57BL/6小鼠和ND2:SmoA1小鼠的腦脈管系統(tǒng)NIR-II熒光圖像以及(b)放大圖像。(c)使用血管分割和量化算法，對野生型和荷瘤小鼠的腦血管系統(tǒng)中的血管長度和血管分支進行定量比較。

接下來，作者使用NIR-II Pdots和Hessian矩陣法探索了小鼠腦深部組織血管成像。對正常小鼠和攜帶腦腫瘤的轉(zhuǎn)基因ND2:SmoA1小鼠進行了頭皮和顱骨腦部成像。與野生型動物相比，由于腫瘤的發(fā)展，ND2:SmoA1小鼠顯示出更扭曲和紊亂的腦脈管系統(tǒng)，從原始熒光圖像中很難識別橫竇和小直徑血管的輪廓，經(jīng)Hessian矩陣法圖像處理后，原始圖像中多條小血管明顯增強，橫竇結(jié)構(gòu)清晰。為了評估腫瘤生長中的血管形態(tài)，還定量分析了血管長度和血管分支，這些在原始圖像中是無法獲得的，因為它們的圖像對比度低。從增強圖像中提取的血管長度和血管分支統(tǒng)計分析表明，轉(zhuǎn)基因腦腫瘤小鼠的這兩個參數(shù)均顯著高于野生型小鼠。血管形態(tài)的定量評估為研究腫瘤血管生成和診斷腫瘤惡性提供了一種有效方法。

接下來，進一步證明了使用NIR-II Pdots和Hessian矩陣方法在體外可視化大鼠肝臟血管結(jié)構(gòu)的可行性。由于肝組織的強散射和吸收以及肝血管的復雜結(jié)構(gòu)，肝血管成像是一項復雜的任務。原始圖像在高度混濁的肝組織中顯示出非常弱的熒光信號，而Hessian-matrix增強圖像顯示出高得多的SBR，肝血管成像中SBR的20倍以上增強。這些結(jié)果驗證了Hessian矩陣用于血管成像的有效性，并為研究肝臟疾病中血管結(jié)構(gòu)的發(fā)展提供了工具。

圖7. (a)顱骨完整的SD大鼠的腦脈管系統(tǒng)的體內(nèi)NIR-II熒光圖像和Hessian基質(zhì)增強圖像與(b)橫截面強度分布。(c)大鼠切除的腦組織的亮場和熒光圖像。(d) H&E染色圖像。(e)健康大鼠和荷瘤大鼠腦切片熒光圖像。

最后，作者探索了大鼠模型中原位成膠質(zhì)細胞瘤的顱骨內(nèi)腦血管成像。由于顱骨更厚且光子散射更強，因此將大鼠腦可視化比將小鼠腦可視化更具挑戰(zhàn)性。圖像經(jīng)Hessian矩陣法處理后，原始圖像中的小直徑血管明顯增強，腦血管結(jié)構(gòu)更加清晰可見且增強圖像中的SBR有明顯改善，與小鼠腦和肝血管成像結(jié)果一致。此外，進行離體NIR-II熒光成像，在來自不同組的切除的腦器官的亮場和熒光圖像中，模型組腫瘤部位可見亮熒光，而對照組和假組未檢測到明顯信號。該結(jié)果表明，由于滲透性和滯留性增強(EPR)效應，Pdots在腦腫瘤中有效蓄積。對照組和荷瘤組腦切片的H&E染色圖像，證實了腦中腫瘤的發(fā)展。除了鏈式堆積調(diào)制時，CN-PPV聚合物的混合也賦予Pdots橙色發(fā)射，從而能夠通過常規(guī)共焦成像對組織切片進行顯微鏡檢查，腦切片的共焦熒光圖像表明Pdots在腦腫瘤中明顯積聚?？傊@些結(jié)果證明了使用NIR-II熒光Pdots和Hessian矩陣法進行的大鼠腦高對比度顱骨血管成像。

總結(jié)：作者設計了熒光Pdots并且開發(fā)了一種圖像算法，用于小動物的高對比度血管成像。作者提出了一種聚合物共混策略，該策略可以有效地調(diào)節(jié)大的剛性NIR-II半導體聚合物的鏈堆積行為，產(chǎn)生用于小血管體內(nèi)熒光成像的致密明亮的Pdots。此外，作者開發(fā)了一種有效的Hessian矩陣方法來增強血管結(jié)構(gòu)的圖像對比度，特別是小的和弱熒光的血管。在全身小鼠成像中，與原始圖像相比，增強的血管圖像在SBR中表現(xiàn)出超過一個數(shù)量級的改善。進一步證明了使用NIR-II Pdots和Hessian矩陣法離體可視化大鼠肝臟血管結(jié)構(gòu)的可行性。原始圖像顯示高度混濁的肝組織的血管網(wǎng)絡非常模糊，而Hessian矩陣圖像在肝血管成像中顯示SBR增強20倍以上。利用明亮的Pdots和Hessian矩陣法，最終進行了顱骨內(nèi)熒光成像，并在荷腦腫瘤的小鼠和大鼠模型中獲得了高對比度的腦脈管系統(tǒng)。本研究將成像算法與NIR-II熒光Pdots相結(jié)合，顯示出其在體內(nèi)促進腫瘤血管生成及其他微循環(huán)相關(guān)疾病定量成像與研究的潛力。

參考文獻

Chen, D.; Qi, W.; Liu, Y.; Yang, Y.; Shi, T.; Wang, Y.; Fang, X.; Wang, Y.; Xi, L.; Wu, C., Near-Infrared II Semiconducting Polymer Dots: Chain Packing Modulation and High-Contrast Vascular Imaging in Deep Tissues. ACS Nano 2023, 17 (17), 17082-17094.

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近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀

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