本文要點(diǎn)：基于稀土摻雜納米晶體(RENC)的短波紅外(SWIR，1000-3000 nm)熒光生物成像具有更深的穿透深度和更高的清晰度，然而，它們的降頻發(fā)射很少能在超過(guò)1600 nm外顯示足夠的亮度，特別是在NIR-IIc中。本文提出了一類銩(Tm)自敏化RENC熒光探針，它在1600-2100 nm(NIR-IIb/c)處顯示出明亮的降頻發(fā)光，可用于活體生物成像。惰性外殼涂層蕞大限度地減少了表面猝滅，并結(jié)合了強(qiáng)交叉弛豫，允許LiTmF4@LiYF4納米粒子通過(guò)吸收800 nm(大斯托克斯位移~1000 nm，jue對(duì)量子產(chǎn)率~14.16%)或1208 nm(NIR-IIin和NIR-IIout)的近紅外光子來(lái)發(fā)射強(qiáng)降頻發(fā)射。此外，摻雜Er3+進(jìn)行能量俘獲，實(shí)現(xiàn)了四波長(zhǎng)的近紅外輻射和明亮的NIR-IIb/c發(fā)射。我們的結(jié)果表明，基于Tm3+的NIR-IIb/c納米探針具有高信噪比和清晰度，為未來(lái)應(yīng)用和轉(zhuǎn)化到不同領(lǐng)域提供了新機(jī)會(huì)。近紅外二區(qū)小動(dòng)物活熒光成像系統(tǒng) - MARS

短波紅外(SWIR，1000-3000 nm)，也被定義為第二近紅外區(qū)(NIR-II)，在生理研究和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有廣闊的應(yīng)用前景。在這一區(qū)域，超過(guò)1500 nm的發(fā)射被認(rèn)為是另一個(gè)具有更高空間分辨率和更深成像深度的成像窗口。值得注意的是，NIR-IIb(1600-1700 nm)、NIR-IIc(1700-2000 nm)和NIR-IId/NIR-III(2100-2300 nm)波段的長(zhǎng)端顯示出低散射損失和接近于零的自發(fā)熒光，這進(jìn)一步提高了空間分辨率、信號(hào)背景比(SBR)和成像穿透深度，以實(shí)現(xiàn)更好的生物成像清晰度。然而，迄今為止，發(fā)射超過(guò)1600 nm的NIR-IIb熒光/發(fā)光探針仍然非常有限，僅有報(bào)道尾部延伸至1600 nm的AIEgens和硫化鉛(PbS)/硫化鎘(CdS)量子點(diǎn)。這些關(guān)鍵波長(zhǎng)區(qū)域需要更多的具有高效率、低細(xì)胞毒性、大斯托克斯位移和光穩(wěn)定性的清晰且更亮的探針。

稀土摻雜納米晶體(RENC)由于其近紅外激發(fā)帶、窄發(fā)射帶和上述其他所需的優(yōu)點(diǎn)，已成為理想的NIR-II成像納米探針，在多路傳感、時(shí)間門控檢測(cè)、成像引導(dǎo)治療和外科手術(shù)中具有巨大的潛力。據(jù)報(bào)道，有幾個(gè)離子在NIR-II區(qū)有發(fā)射，包括在1185 nm處的Ho3+，1060 nm，1310 nm處的Nd3+，1525 nm處的Er3+，以及1450 nm處的Tm3+(圖1a)。Tm3+是少數(shù)幾種表現(xiàn)出從紫外到中紅外區(qū)域的不同光譜轉(zhuǎn)換的RE3+離子之一。通常報(bào)道的Tm3+在近紅外-II區(qū)的斯托克斯或下移發(fā)光(DSL)位于1450 nm(3H4→3F4，弱躍遷)，顯示出低發(fā)光效率，并在該區(qū)域與水強(qiáng)吸收競(jìng)爭(zhēng)(圖1a)。因此，這極大地限制了基于Tm的探針在NIR-II區(qū)域進(jìn)行光學(xué)成像。然而Tm3+的3F4→3F6躍遷顯示出從1600到2100 nm的強(qiáng)烈發(fā)射波段，通過(guò)進(jìn)一步將穿透深度增加到亞厘米水平并消除自發(fā)熒光，可以實(shí)現(xiàn)高對(duì)比度的深層組織成像(圖1a)。到目前為止，Tm3+(1600-2100 nm)的這種光譜特性主要用作塊狀激光玻璃的激光應(yīng)用的增益材料，還沒(méi)有利用Tm3+的NIR-IIb/c區(qū)發(fā)射用于活體生物成像的報(bào)道。這可能是由于在制備明亮的Tm摻雜納米顆粒過(guò)程中存在嚴(yán)重的濃度猝滅和表面猝滅，以及不適當(dāng)?shù)拿艋瘎┧隆?/span>

在這里，為了滿足NIR-IIb或NIR-IIc發(fā)射探針的要求，本文shou次提出了用于活體生物成像的高摻雜Tm3+離子自敏化納米顆粒。在本研究的設(shè)計(jì)中，Tm3+離子同時(shí)作為敏化劑和激活劑來(lái)吸收800 nm(近紅外-I)或1208 nm(近紅外-II)的光子，由于這種輻射躍遷引起的強(qiáng)烈的交叉弛豫(CR)，它們產(chǎn)生了有效的1600-2100 nm斯托克斯發(fā)射(3F4→3H6)。此外，還合理地?fù)诫s了能量陷阱離子，如Er3+和Dy3+，以介導(dǎo)Tm3+敏化的下移發(fā)射。這些明亮的Tm納米粒子使得非侵入性深層組織成像能夠在SWIR窗口中以更高的質(zhì)量和清晰度研究生物相互作用。

研究?jī)?nèi)容：在生物成像應(yīng)用之前，首先系統(tǒng)地研究和比較了惰性/未摻雜殼層對(duì)重度摻雜Tm3+納米顆粒發(fā)光的影響。補(bǔ)充圖1a和圖1c中的透射電子顯微鏡圖像表明，所得到的純LiTmF4核和Tm@Y核殼納米粒子(Tm-NPs)具有均勻的形貌，平均尺寸分別為~9.8 nm×13.7 nm和~19.3 nm×24.8 nm(寬度×高度)。粉末X射線衍射分析表明，它們的表面形貌為四方的(I41/a)空間群。Tm-NPs的衍射峰與四方LiYF4晶體的參考圖很好地對(duì)應(yīng)，表明形成了純相納米晶體(圖1d)。Tm-NPs的HAADF STEM圖像和元素映射結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了它們的核-殼結(jié)構(gòu)，成分邊界清晰，產(chǎn)生了明亮的Tm3+核和深色的Y3+殼(圖1e)。

接著研究單一Tm摻雜的膠體納米晶體的發(fā)光性質(zhì)。Tm-NPs在環(huán)己烷溶液中的下轉(zhuǎn)移發(fā)光（DSL）為1600~2100 nm，這歸因于3F4→3H6在800 nm光照射下的躍遷。由于Stark分裂的襯底具有3F4態(tài)，~1800 nm處的多波段發(fā)射光譜位于NIR-IIb/c區(qū)，適合NIR-II成像。然而，與干燥的TM-NPs的全光譜(圖1a)相比，作為溶劑的環(huán)己烷由于其自身的強(qiáng)NIR-IIc吸收而嚴(yán)重猝滅了1680-1900 nm附近的發(fā)光。

圖1

對(duì)于Tm3+的濃度介導(dǎo)的DSL，在納米材料(僅核心)中也發(fā)生了嚴(yán)重的濃度猝滅，但在LiYF4殼的外延生長(zhǎng)之后，觀察到DSL強(qiáng)度的穩(wěn)定增加(圖2a)。電子填充過(guò)程可以解釋Tm-NPs的強(qiáng)濃度依賴性發(fā)光現(xiàn)象，如圖2c所示。Tm3+離子通過(guò)激發(fā)電子直接敏化吸收800 nm光子，并通過(guò)從3H4到3F4(1450 nm)，然后從3F4到3H6 (1600-2100 nm)的兩個(gè)連續(xù)輻射躍遷路徑填充3H4態(tài)。3H4與3F4能級(jí)和3F4到基態(tài)之間的能隙分別約為6850 cm?1和5890 cm?1。這兩個(gè)緊密的能隙使得3H4→3F4和3H6→3F4躍遷之間能產(chǎn)生高效的Tm3+→Tm3+ CR，這保證了更多被吸收的光子填充到中間3F4能級(jí)，然后躍遷到基態(tài)(3H6) 以增加NIR-II發(fā)射強(qiáng)度。盡管3F4→3H6躍遷的發(fā)光單調(diào)增加，但隨著Tm3+摻雜濃度從10%增加到40%，Tm-NPs的衰減時(shí)間逐漸減少，隨著Tm3+摻雜濃度從60增加到100，在1680 nm處的發(fā)射壽命可能由于尺寸差異而增加(圖2b)。1450 nm發(fā)射壽命進(jìn)一步證明了3H4和3F4能級(jí)種群競(jìng)爭(zhēng)的濃度依賴性。隨著Tm3+濃度的增加，發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)一步減弱，因?yàn)橹饾u增加的CR抑制了3H4態(tài)的自發(fā)發(fā)射，同時(shí)增加了3F4的數(shù)量。LiYF4的殼層厚度從~ 1.7、2.8 nm增加到5.0 nm，正如預(yù)期的那樣，在800 nm激發(fā)時(shí)，發(fā)射顯著增加(圖2d)，這表明外延惰性殼與耦合到表面的Tm3+激活劑分離。在1680 nm處發(fā)射的熒光壽命由0.2 ms和0.8 ms變化為5.2 ms，表明LiYF4殼體增厚降低了表面淬滅，在2.8 ~ 5.0 nm范圍內(nèi)壽命對(duì)殼體厚度特別敏感。鑒于此，推測(cè)這一現(xiàn)象可以從兩個(gè)方面解釋:(1)惰性殼抑制了濃度和表面淬滅，以及(2)Tm3+濃度的增加增強(qiáng)了CR過(guò)程。

值得注意的是，摻雜高濃度的Tm3+使Tm-NPs在NIR-II區(qū)域(1208 nm, 3H5狀態(tài))激發(fā)，(800 nm處吸收截面為8.25 × 10?22 cm2, 1208 nm處吸收截面為1.5 × 10?21 cm2)。這些Tm-NPs在1208 nm的照射下產(chǎn)生的發(fā)射峰和分支比與在800 nm激發(fā)下看到的相同。隨著Tm3+離子濃度的增加或殼層厚度的變化，分別觀察到DSL發(fā)射增強(qiáng)，且趨勢(shì)相同(圖2e)，說(shuō)明這些發(fā)射波段來(lái)自相同的躍遷過(guò)程。這是di一次報(bào)道在可分散的NPs中觀察到Tm3+在1600-2100 nm的發(fā)射，特別是在800 nm和1208 nm激發(fā)時(shí)。

接下來(lái)，選擇了與Tm3+能級(jí)匹配的摻雜離子（如Er3+和Dy3+）用于能量捕獲，旨在提供更明亮的NIR-II發(fā)射。首先在800 nm激發(fā)下研究了Er3+離子摻雜劑。其中，當(dāng)摻雜Er3+時(shí)(<1%，0.2%為蕞佳，Tm(02Er)-NPs)，1680 nm處的下轉(zhuǎn)移發(fā)射得到了提高，摻雜更多的Er3+導(dǎo)致了下降趨勢(shì)(圖2f)。此外，研究3F4狀態(tài)下相應(yīng)的時(shí)間分辨種群(圖2g)。通過(guò)Tm3+和Er3+之間的能量轉(zhuǎn)移，抑制Tm3+的CR，加速了3F4狀態(tài)的減少(圖2 h)。當(dāng)Er3+摻雜濃度進(jìn)一步增加到10%以上時(shí)，雖然在1600-2100 nm處的發(fā)射強(qiáng)度有所降低，但在近紅外區(qū)域，通過(guò)四波長(zhǎng)照射，甚至可以激發(fā)得到Tm/Er“合金"NPs(如30%Er摻雜，Tm(30Er)-NPs)，并分別在980 nm和1530 nm激發(fā)時(shí)觀察到附加發(fā)射帶(圖2i，吸收截面:800 nm時(shí)9.5 × 10?22 cm2, 980 nm時(shí)1.075 × 10?21 cm2, 1208 nm時(shí)1.75 × 10?21 cm2, 1530 nm時(shí)2.12 × 10?21 cm2)。值得注意的是，由于4I13/2水平的Er3+種群的增加，也發(fā)生了1525 nm輻射(4I13/2→4I15/2)，如在980 nm激發(fā)下。此外，在800 nm激發(fā)(4 W/cm2)下，Tm-NPs的發(fā)光量子產(chǎn)率(1600-2050 nm)為~14.16%，Tm(02Er) NPs的發(fā)光量子產(chǎn)率為~16.13%。這些“合金"NPs為成像、防偽等涉及多波長(zhǎng)選擇性激發(fā)調(diào)節(jié)的應(yīng)用開辟了新的途徑。然而，摻雜Dy3+并沒(méi)有提高近紅外發(fā)射，在Tm3+晶格中摻雜少量Dy3+(0.2%)會(huì)被強(qiáng)烈淬滅，因?yàn)?span style="box-sizing: border-box">Dy3+具有密集的階梯狀能級(jí)。

圖2

基于Tm的NPs進(jìn)行表面修飾，以提高其生物相容性

對(duì)于生物成像，選擇優(yōu)化的Tm(02Er)-NPs，并使用DSPE- PEG2000通過(guò)疏水-疏水相互作用進(jìn)行修飾(圖3a)。聚乙二醇化后得到Tm(02Er)-NPs@PEG, TEM圖像如圖3b所示，無(wú)明顯聚集，動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定的水動(dòng)力直徑為112±0.7 nm(圖3c)。監(jiān)測(cè)長(zhǎng)期膠體穩(wěn)定性1個(gè)月。如圖3d所示，在這段時(shí)間內(nèi)沒(méi)有發(fā)生明顯的尺寸變化，也沒(méi)有發(fā)生解離或沉淀，說(shuō)明Tm探針在水溶液中分散良好且穩(wěn)定。由于O?H振動(dòng)的非輻射失活(圖3e)， Tm探針在水溶液中的發(fā)光強(qiáng)度比在環(huán)己烷中下降得更多(9.4倍，在1680 nm處計(jì)算)。然而，1738 nm處的DSL強(qiáng)度與1680 nm發(fā)射處的DSL強(qiáng)度之比從0.37(環(huán)己烷)增加到0.76(水)，這是因?yàn)樵谠搮^(qū)域水的吸收比環(huán)己烷低(圖1a)。

值得注意的是，Tm3+的DSL可以從NIR-IIb到NIR-IIc。以發(fā)射在NIR-IIb區(qū)域(1525 nm)的基于Er的NPs為參考，量化NIR-IIc發(fā)射的優(yōu)勢(shì)。在800 nm激發(fā)下，在NIR-IIb和NIR-IIc下，記錄了相同濃度的基于Er-和Tm -NPs的相似發(fā)射強(qiáng)度(圖3e)，隨后使用HgCdTe (MCT)相機(jī)在不同的子窗口中成像(圖3f)。兩種探針?lè)謩e在1524-1536 nm和>1700 nm范圍內(nèi)可以清晰區(qū)分。此外，盡管兩者都可以在1500-1700nm的子窗口成像，但隨著長(zhǎng)通濾波器從1500、1600到1700nm的變化，Er-NPs@PEG逐漸變得無(wú)法檢測(cè)到而明亮的基于Tm的探針仍然存在。這些結(jié)果表明，基于Tm的NPs可以作為NIR-IIb/c的優(yōu)秀候選。此外，在相同強(qiáng)度下，填充這些納米探針的毛細(xì)血管的發(fā)光圖像顯示，當(dāng)SBR為1.35,FWHM = 0.55 mm的5 mm厚的1%脂內(nèi)溶液覆蓋時(shí)，仍然可以觀察到基于Tm的NPs的發(fā)射，而Er-NPs@PEG的發(fā)射幾乎無(wú)法檢測(cè)到，這表明在NIR-IIb/c區(qū)域使用基于Tm的NPs具有相當(dāng)大的穿透性和清晰度(圖3g, h)。此外，24小時(shí)CCK8檢測(cè)顯示，即使?jié)舛雀哌_(dá)800µg/mL, Tm納米探針的細(xì)胞毒性也很低(>90%存活率)。

圖3

體內(nèi)成像研究

為了評(píng)估使用基于Tm的探針成像的可行性，并在NIR-IIb/c中實(shí)現(xiàn)理想的清晰度和深層組織穿透，shou次在800 nm激發(fā)下使用MCT相機(jī)檢測(cè)超過(guò)1700 nm的發(fā)光來(lái)驗(yàn)證小鼠的全身血管成像和血液循環(huán)。強(qiáng)烈的NIR-IIc信號(hào)使注射后2分鐘循環(huán)系統(tǒng)清晰可見。信號(hào)隨注射后時(shí)間的增加而減小。隨著時(shí)間推移，肝臟清晰可見(圖4a)，表明Tm-探針主要通過(guò)肝膽系統(tǒng)代謝。此外，由同一血管測(cè)定的NIR-IIc信號(hào)強(qiáng)度在血液中表現(xiàn)出中等的半衰期(49 min)，可以勾畫出病理狀態(tài)下的血管血流動(dòng)力學(xué)。與超過(guò)1500 nm成像(FWHM = 78µm)相比，通過(guò)高斯擬合測(cè)量FWHM，確定NIR-IIc區(qū)域血管寬度為64µm(圖4b)，這表明NIR-IIc成像的空間分辨率提高了。這些結(jié)果證實(shí)了NIR-IIc區(qū)域的高分辨率成像性能。

此外，使用MCT和InGaAs (SD 640)攝像機(jī)進(jìn)行血管成像，以確認(rèn)基于Tm的探針在NIR-IIb區(qū)域的成像輪廓。結(jié)果表明，兩者的組織SBR相似(~2.2)。而在相同條件下，除了InGaAs相機(jī)采用高增益模式外，MCT相機(jī)的背景噪聲較低。這表明基于Tm的探針是優(yōu)秀的NIR-IIb成像探針，它也可以在InGaAs相機(jī)上成像良好。同時(shí)，Tm探針在1500 - 1600 nm之間具有微弱的發(fā)射，因此使用1500 nm LP在NIR-IIb窗口的探測(cè)主要從1600 nm開始。此外，用Tm探針處理的小鼠的組織學(xué)評(píng)估顯示，主要器官?zèng)]有明顯損傷。最后，采用Tm探針進(jìn)行NIR-IIc成像，建立手術(shù)誘導(dǎo)的大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型，以可視化血液循環(huán)系統(tǒng)功能障礙。成像結(jié)果顯示循環(huán)障礙，并且小鼠機(jī)體通過(guò)自我保護(hù)機(jī)制建立了側(cè)支循環(huán)。

此外，為了證明在1700-2100 nm范圍內(nèi)檢測(cè)NIR-IIc成像的優(yōu)勢(shì)，將Tm(02Er)-NPs@PEG和Er-NPs@PEG探針(相同濃度)的混合物靜脈注射到小鼠體內(nèi)，并用MCT相機(jī)在800 nm激發(fā)下成像。如圖4d, e所示，NIR-IIc成像的SBR(1.56)高于NIR-IIb成像(SBR = 1.27)。并且，與NIR-IIb相比，NIR-IIc窗口可以更清晰地觀察到微小的血管(包括Tm3+的部分發(fā)光)，這意味著比基于Er (NIR-IIb)的探針成像深度更深，清晰度更高。接著在口服灌胃小鼠兩種發(fā)光強(qiáng)度相同的探針的混合物后，進(jìn)行胃腸道成像。灌胃1.5 h后，評(píng)價(jià)NIR-II在不同子窗口的成像性能。與Er納米探針的NIR-IIb成像(SBR = 5.4)相比，Tm基探針在NIR-IIc區(qū)域觀察到更高的SBR(8.6)(圖4f, g)。本文認(rèn)為在1700-2100 nm子窗口的熒光/發(fā)光成像是一個(gè)重大突破，因?yàn)樵?span style="box-sizing: border-box">1880 nm附近光吸收增加，光子散射最小化，組織自身熒光進(jìn)一步被抑制。

繼續(xù)使用Tm(30Er)-NPs@PEG探針進(jìn)行了體外和體內(nèi)成像，以提供多波長(zhǎng)激發(fā)特性的概念證明。使用1%的脂內(nèi)溶液驗(yàn)證Tm(30Er)NPs@PEG的NIR-IIc成像特性。在800 nm、980 nm和1208 nm激發(fā)下，可以觀察到類似的穿透深度和SBR。其中，在800 nm激發(fā)下，侵徹深度最深。但是，在1530 nm激發(fā)時(shí)，由于水的強(qiáng)烈吸收，導(dǎo)致滲透深度蕞低(3 mm厚度以內(nèi))。進(jìn)行胃腸道成像。在灌胃30 min后記錄NIR-IIc的發(fā)光信號(hào)(1750-2250 nm)。SBR結(jié)果(圖4h)顯示，800,980和1208 nm激發(fā)提供了優(yōu)秀的NIR-IIc成像。但是在1530 nm激發(fā)時(shí)，由于水在1500 nm附近有強(qiáng)烈的吸收峰，無(wú)法獲得高質(zhì)量的寬場(chǎng)成像。

最近有報(bào)道稱，在1540 nm或1650 nm激發(fā)下，NIR-IIc共聚焦顯微鏡可實(shí)現(xiàn)穿透深度為~500 μm的腹股溝淋巴結(jié)成像，其穿透深度是1200-1400 nm范圍內(nèi)的兩倍。但是，需要更高的功率密度的1540nm的光。這些結(jié)果表明，如果通過(guò)增加激發(fā)功率或提高探針亮度來(lái)克服由于吸水引起的干擾，那么將激發(fā)和發(fā)射擴(kuò)展到NIR-II可以提高成像性能。由此可見，這種多波長(zhǎng)激發(fā)和發(fā)射系統(tǒng)(圖4i)為多通道成像/解耦治療提供了蕞佳選擇。

圖4

結(jié)論：本文成功開發(fā)了一種高效的基于Tm3+的NIR-II發(fā)光納米探針，其發(fā)射波長(zhǎng)約為1800 nm，具有良好的生物相容性和良好的穩(wěn)定性。納米探針在800和1208 nm進(jìn)行雙波長(zhǎng)激發(fā)，表現(xiàn)出NIR-IIb到NIR-IIc發(fā)射(1600-2100 nm,3F4→3H6)。這種qian所未有的光學(xué)特性將為體內(nèi)高對(duì)比度深層組織成像提供替代方案。值得注意的是，本文的研究結(jié)果表明，Tm探針輔助NIR-IIc成像在穿透深度和清晰度方面明顯優(yōu)于NIR-IIb子窗口，這可能是由于受限的散射背景。重要的是，在這項(xiàng)工作中，濾波片和成像探針的發(fā)射特性共同決定了實(shí)際的成像窗口。要詳細(xì)地分析窗口的優(yōu)勢(shì)，未來(lái)的研究必須盡可能地保證特定窗口內(nèi)的均勻發(fā)射和檢測(cè)。預(yù)計(jì)本項(xiàng)工作將促進(jìn)NIR-IIc區(qū)域所需的、具有更高量子產(chǎn)率的探針的研究和開發(fā)。

參考文獻(xiàn)

Chang, Y.; Chen, H.; Xie, X.; Wan, Y.; Li, Q.; Wu, F.; Yang, R.; Wang, W.; Kong, X., Bright Tm(3+)-based downshifting luminescence nanoprobe operating around 1800 nm for NIR-IIb and c bioimaging. Nat Commun 2023, 14 (1), 1079.

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