本文要點(diǎn)：利用光學(xué)技術(shù)對(duì)早期發(fā)育階段的斑馬魚心血管系統(tǒng)進(jìn)行無(wú)chuang分析時(shí)，主要基于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡元件和圖像傳感器，采集和分析的光的波長(zhǎng)范圍在400-900 nm范圍內(nèi)。本文比較了使用可見(jiàn)光和近紅外范圍(VISNIR) 400-1000 nm和短波紅外范圍(SWIR) 900-1700 nm的無(wú)chuang光學(xué)方法。在這些波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)量斑馬魚組織的透射光譜，然后根據(jù)VISNIR和SWIR的數(shù)據(jù)計(jì)算血管圖、心率和血流速度。SWIR中記錄了更高的色素圖案透明度，而在此范圍內(nèi)的心臟和血管檢測(cè)質(zhì)量不低于VISNIR。所獲得的結(jié)果表明，SWIR成像用于監(jiān)測(cè)斑馬魚胚胎和幼蟲(chóng)的心臟功能和血流動(dòng)力學(xué)分析的效率更高，并表明與其他受色素模式發(fā)育限制的光學(xué)技術(shù)相比，SWIR成像可支持更長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃。

背景：斑馬魚(Danio Rerio)是一種小型鯉科魚類，是研究脊椎動(dòng)物包括人類疾病各種過(guò)程的蕞常見(jiàn)的模式生物之一。在過(guò)去的幾十年里，由于其基因組中存在人類疾病基因和胚胎的光學(xué)透明度，斑馬魚一直被積極地用于模擬心血管病理。光學(xué)方法是對(duì)早期發(fā)育階段的斑馬魚心血管系統(tǒng)進(jìn)行非侵入性研究的蕞常見(jiàn)方法。在斑馬魚模型中，這些技術(shù)被用作檢查先天性心臟病、心肌病以及各種因素對(duì)心血管系統(tǒng)功能的影響的工具。此外，透明的斑馬魚胚胎可以用于研究心血管表型以及血流動(dòng)力學(xué)與癌細(xì)胞遷移能力的關(guān)系。

如今，光學(xué)相干層析成像使斑馬魚內(nèi)部的微米分辨率可視化成為可能。當(dāng)其與光聲學(xué)、血管造影術(shù)或其他成像手段相結(jié)合時(shí)，是識(shí)別和研究特定組織的可靠工具。共聚焦顯微鏡和光片顯微鏡提供了斑馬魚心臟和血管的更詳細(xì)的結(jié)構(gòu)，但需要長(zhǎng)期掃描和血細(xì)胞標(biāo)記。染料的熒光可以進(jìn)行準(zhǔn)確的高對(duì)比度心血管成像。沒(méi)有這兩種顯微鏡及染料，就需要大量的圖像分割和分析算法。無(wú)標(biāo)簽且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的心跳測(cè)量和血管測(cè)繪的光學(xué)方法主要基于時(shí)差分析，也就是說(shuō)在顯微鏡明場(chǎng)圖像中跟蹤與血液脈動(dòng)相關(guān)的時(shí)間變化。

光學(xué)技術(shù)在可見(jiàn)光下的一個(gè)重要限制，來(lái)自于色素圖案的形成導(dǎo)致的胚胎透明度降低。野生型斑馬魚中黑色素細(xì)胞的定位和轉(zhuǎn)變，將使用光學(xué)方法的長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)計(jì)劃限制在在受精后1-2周。過(guò)去開(kāi)發(fā)了1-苯基-2-硫脲的應(yīng)用和基因組干預(yù)的方法，以達(dá)到在更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持斑馬魚胚胎透明度的目的，但基因組干預(yù)或化學(xué)試劑的應(yīng)用可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，實(shí)驗(yàn)計(jì)劃可能建議只使用野生斑馬魚。因此，允許忽略黑色素細(xì)胞的光學(xué)方法的發(fā)展，關(guān)系到斑馬魚胚胎和魚類胚胎模型的應(yīng)用。

SWIR(900-1700 nm)的光學(xué)技術(shù)是克服這一問(wèn)題的方法之一。該范圍內(nèi)的光具有減少散射和在生物組織中具有更高穿透深度的優(yōu)點(diǎn)。SWIR相機(jī)的上市使多種高靈敏度成像方式成為可能。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了斑馬魚組織在SWIR中的光學(xué)透明度比在VISNIR中的高，SWIR成像可以更有效地進(jìn)行典型的心血管成像觀察。

Figure 1

這項(xiàng)研究包括兩個(gè)階段(圖1)。第yi個(gè)階段的目的是測(cè)量斑馬魚組織的光譜特性，并證明SWIR在光學(xué)透過(guò)率方面比VISNIR具有潛在的優(yōu)勢(shì)。在第二階段，我們通過(guò)計(jì)算血管地圖、心率和血流速度，定量比較了VISNIR和SWIR對(duì)心血管系統(tǒng)的表征。

Figure 2

首先是光學(xué)透明度測(cè)量。圖2a和2b顯示了眼睛、卵黃、肌肉、心臟和耳石的VISNIR(400-900 nm)和SWIR(900-1700 nm)圖像，這些器官具有不同的結(jié)構(gòu)和特性。本文手動(dòng)選擇與它們相關(guān)的區(qū)域(圖2c中的彩色陰影區(qū)域)并標(biāo)記顏料圖案，以查看其在VISNIR中的弱透明度在SWIR中是否有所不同。通過(guò)在顯微鏡照明系統(tǒng)中安裝窄帶濾光片，獲得了15幅斑馬魚麻醉后的光譜圖像，計(jì)算了選定器官I(λi)(i=1，2，…，15)和無(wú)標(biāo)本背景B(λi)的平均強(qiáng)度隨波長(zhǎng)的變化關(guān)系，并計(jì)算了T(λi)=I(λi)/B(λi)的透射譜。圖2d顯示了超過(guò)5個(gè)樣本的平均箱線圖T(λi)。由于圖2d中灰色垂直條紋所示的1450 nm附近的高吸水率，認(rèn)為該波長(zhǎng)帶內(nèi)的T(λi)的值是不可靠的，因此跳過(guò)它。圖2d中顯示的數(shù)據(jù)清楚地表明，在SWIR中，所有斑馬魚器官的光透過(guò)率T(λi)增加了1.5-2.5倍。肌肉、卵黃、心臟和色素皮膚在850-1600 nm的整個(gè)范圍內(nèi)始終保持70%-90%的透明度。

Figure 3

接著進(jìn)行心血管研究，首先是血管成像研究。圖3展示了斑馬魚身體的典型VISNIR和SWIR圖像。一旦原始序列的圖像被匹配，通過(guò)視頻毛細(xì)血管鏡即可計(jì)算血流圖，即通過(guò)突出顯示強(qiáng)度變化對(duì)應(yīng)于心臟活動(dòng)的像素來(lái)計(jì)算強(qiáng)度變化的二維分布和血管圖像。從VISNIR圖像（上行）中檢測(cè)嚴(yán)重色素沉著區(qū)域的血管幾乎是不可能的。在圖3所示的個(gè)體中，標(biāo)有黃色的色素圖案覆蓋了大部分的主靜脈和部分節(jié)段動(dòng)脈，這就導(dǎo)致在重建的血管圖像中沒(méi)有這些血管（圖3b上行）。而在SWIR圖像中，該色素是透明的（圖3a下行），因此幾乎不影響SWIR圖像處理算法的血流檢測(cè)能力。從SWIR系列圖像重建的血管圖顯示了更詳細(xì)的血管結(jié)構(gòu)，包括那些被色素沉積圖案隱藏的血管（圖3b下行）。

Figure 4

收集8張重疊20%-30%的圖像，計(jì)算血管地圖，并將它們拼接成無(wú)縫全景圖，在VISNIR和SWIR中獲得整個(gè)動(dòng)物的高分辨率血管圖像(圖4)。在SWIR全景圖(圖4b)中，可以在頭部、身體和尾部看到多條血管，這些血管在VISNIR(圖4a)中是不存在的。同樣，由于SWIR的透明度，魚全身的色素沉著幾乎不會(huì)影響光學(xué)測(cè)量。

Figure 5

其次是心率的測(cè)量。心率是心臟功能和整體健康的主要指標(biāo)。它的測(cè)量最直接的方法之一是光體積描記術(shù)(PPG)，即跟蹤血液循環(huán)的體積變化。本文在VISNIR和SWIR中實(shí)現(xiàn)了這種心率測(cè)量方法。本文選擇了心臟區(qū)域(圖5a中用彩色框突出顯示)，并計(jì)算了其平均強(qiáng)度的時(shí)間依賴性（圖5b）。在減去低頻分量之后，得到可以分析和比較的歸一化PPG信號(hào)(圖5c)。實(shí)驗(yàn)表明，VISNIR和SWIR成像都能提供清晰穩(wěn)定的周期性PPG信號(hào)。雖然VISNIR中的心跳信號(hào)的幅度是VISNIR的4-5倍，形狀更詳細(xì)，但這兩種信號(hào)都很適合心率測(cè)量。在圖6所示的例子中，用VISNIR和SWIR測(cè)量的心率分別為161次/分和164次/分。這些值與過(guò)往研究中獲得的數(shù)據(jù)接近。

Figure 6

最后是血流速度的測(cè)量。血流速度是定量描述心功能和了解心血管血流動(dòng)力學(xué)至關(guān)重要的參數(shù)。圖6a顯示了在VISNIR和SWIR中獲取的斑馬魚身體的原始圖像。選擇了大動(dòng)脈(紅色)和主靜脈(藍(lán)色)的區(qū)域(見(jiàn)圖6a和6b)，通過(guò)檢測(cè)這些血管的中心線并計(jì)算每個(gè)點(diǎn)的法線，將它們的軌跡轉(zhuǎn)換為直線，并跟蹤相鄰圖像之間的相對(duì)位移，血流速度即可以計(jì)算為該位移和50赫茲的幀速率的乘積。在VISNIR中，色素沉著的圖案幾乎wan全覆蓋了大靜脈(見(jiàn)圖6a)。因此，血流速度的檢測(cè)和分析只有在短波紅外中才是可行的。圖6b顯示了腹主動(dòng)脈和主靜脈血流速度的時(shí)間依賴關(guān)系。腹主動(dòng)脈和基底靜脈信號(hào)的相移、形狀、速度值(VISNIR：576±450μm/s，SWIR：574±510μm/s和564±112μm/s)以及其他特征與用其他方法獲得的數(shù)據(jù)很好地吻合。同時(shí)還可以通過(guò)簡(jiǎn)單的頻率分析從這些信號(hào)中提取心率。在圖6所示的例子中，VISNIR為161 bpm，SWIR為164 bpm。這些值與從心臟區(qū)域的PPG信號(hào)獲得的值一致(圖5c)。

Table 1

Table 2

表2總結(jié)了與在VISNIR和SWIR中對(duì)兩種斑馬魚4 dpf胚胎進(jìn)行的心血管研究相關(guān)的量化數(shù)據(jù)。PPG信號(hào)的信噪比(SNR)反映了心臟活動(dòng)測(cè)量的可靠性。血管密度被定義為與檢測(cè)到的血流的血管相關(guān)的像素與樣本占據(jù)的總像素量的比例。表2中的量化數(shù)據(jù)顯示了SWIR心血管研究相對(duì)于傳統(tǒng)VISNIR成像的優(yōu)勢(shì)。由于斑馬魚器官的透明度和色素沉著，SWIR圖像的處理在血管測(cè)繪和血流速度測(cè)量方面更具信息量和可靠性。

討論：本文對(duì)VISNIR和SWIR成像的評(píng)估顯示，SWIR中的斑馬魚組織的光學(xué)透過(guò)率顯著增加，色素圖案更透明。同時(shí)，在此范圍內(nèi)獲得的圖像的心臟和血管檢測(cè)質(zhì)量不遜于VISNIR。

SWIR成像允許將野生型斑馬魚的成像周期延長(zhǎng)2-3周，并放棄遺傳或生化操作以增加組織透明度。這種方法可用于在斑馬魚模型中建立復(fù)雜的長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)計(jì)劃（例如，在研究藥物的藥效學(xué)、藥物和異生素的延遲效應(yīng)和生物蓄積、血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)等）。

斑馬魚是目前生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中墜受歡迎的魚類。如今，硬骨魚中的一些其他魚類被探索來(lái)模擬人類疾病。由于魚類的早期發(fā)育的相似性，SWIR成像很有可能作為非侵入性光學(xué)方法，在大多數(shù)硬骨魚的早期發(fā)育階段用于研究其心血管功能和血管造影。

結(jié)論:與VISNIR相比，斑馬魚組織及其色素圖案在SWIR中表現(xiàn)出更高的透明度。這一發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了光學(xué)技術(shù)用于心血管研究的范圍，如監(jiān)測(cè)心臟活動(dòng)和血流成像。即使在存在色素的情況下，SWIR成像也可以對(duì)位于色素后面的血管進(jìn)行非侵入性測(cè)繪和量化。這項(xiàng)研究的結(jié)果可能會(huì)提高多種光學(xué)技術(shù)(光體積描記、光學(xué)相干斷層掃描、高光譜成像等)的效率，同時(shí)這些光學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于研究斑馬魚的發(fā)育動(dòng)力學(xué)和紊亂。

參考文獻(xiàn)

Volkov, M.; Machikhin, A.; Bukova, V.; Khokhlov, D.; Burlakov, A.; Krylov, V., Optical transparency and label-free vessel imaging of zebrafish larvae in shortwave infrared range as a tool for prolonged studying of cardiovascular system development. Sci Rep 2022, 12 (1), 20884.

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