本文要點：第二近紅外（NIR-II，1000-1700 nm）窗口熒光成像引導的光熱治療探針有望用于精確的癌癥光治療診斷學。然而，目前報道的大多數(shù)探針在單個分子中沒有表現(xiàn)出高NIR-II熒光亮度（摩爾吸收系數(shù)（ε）×量子產(chǎn)率（QY））和光熱性能（ε×光熱轉(zhuǎn)換效率（PCE））。本文報道了一種解決這一挑戰(zhàn)的通用策略，即通過制備具有剛性分子骨架和柔性側(cè)基的大π偶聯(lián)分子（BNDI-Me）。所提出的BNDI-Me納米探針提高了ε，同時優(yōu)化了其QY和PCE。因此，高NIR-II熒光亮度（ε × QY = 2296 m?1厘米?1）和強光熱性能（ε×PCE = 82 000）成功地摻入單個小分子中，并且這兩個參數(shù)中的任何一個都優(yōu)于目前墜好的熒光或光熱探針。因此，在全身低注射劑量下獲得了*的體內(nèi)NIR-II成像效果和高光熱腫瘤抑制率（81.2%）。

背景：在單個探針中集成高分辨率的近紅外二區(qū)（NIR-II，1.0-1.7μm）熒光成像和時空可控的發(fā)熱，特別是生物相容性和易于重復的有機小分子，為非侵入性和精確的光治療診斷學方面提供巨大的潛力。目前的NIR-II熒光基團設計策略側(cè)重于通過結(jié)合電子供體（D）和受體（A）單元來創(chuàng)建強大的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）分子骨架。通常，由共價單鍵連接的D/A亞基天然喜歡靈活的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)，這不僅有利于π系統(tǒng)較差的軌道重疊，導致低ε，而且在強極性水生物環(huán)境中將柔性骨架驅(qū)動到扭曲的ICT狀態(tài)，以促進激發(fā)態(tài)的非輻射衰變，導致相對較低的QY和高的PCE。目前流行的改善QY的策略包括將具有立體旋轉(zhuǎn)阻礙的D與分子骨架結(jié)合，以減少靈活的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)。這可能會將QY從1%提高到10%以上，同時將ε從104降低至 ≈103 m?1厘米?1，熒光亮度僅略有提高。本文通過制造具有剛性分子骨架和柔性側(cè)基的大π偶聯(lián)小分子（BNDI-Me）將高NIR-II熒光亮度和光熱性能結(jié)合到單個分子中（方案1）。

方案1

研究內(nèi)容：

1、 分子設計與合成

BNDI-H和BNDI-Me的分子設計如方案1所示。之所以選擇NDI，是因為它具有剛性的大π偶聯(lián)分子骨架，沒有強烈的ICT效應。新的大π偶聯(lián)分子（BNDI-H）具有新設計：它是通過加寬NDI染料的共軛骨架合成的。BNDI-H發(fā)射出現(xiàn)在NIR-II窗口中，因為它具有較大的π共軛效應，而不是強烈的ICT效應。其分子骨架剛性且共軛，沒有強烈的ICT效應，有利于激發(fā)態(tài)的輻射衰變，以確保分子水平上的高QY。然而，剛性和共軛分子骨架傾向于形成平面分子，導致聚集狀態(tài)下強烈的分子間π-π相互作用，這導致嚴重的ACQ，QY顯著降低，水中PCE高。為了克服這個問題，在BNDI-H中間插入了兩個靈活的側(cè)基（甲基）作為空間位阻基和運動亞基。作為空間位阻基團，這些甲基扭曲BNDI-H的平面以增加分子間空間并減少聚集，從而提高NIR-II熒光QY，但降低PCE。此外，作為運動亞基，這些甲基的運動有助于發(fā)熱，從而抵消了由于聚集減少而導致的熱量減少。因此，兩個靈活的側(cè)基優(yōu)化了BNDI-Me NP的QY和PCE，以同時獲得可觀的QY和PCE。此外，BNDI-Me的剛性和共軛分子骨架確保了π系統(tǒng)豐富的軌道重疊，從而產(chǎn)生了高ε。最終，BNDI-Me獲得了高ε，同時優(yōu)化了水中的QY和PCE，在單個分子中結(jié)合了高NIR-II熒光亮度和強大的光熱效應。

2、 光學特性

為了獲得良好的水分散性和生物相容性，疏水性BNDI-H和BNDI-Me與兩親性聚合物F-127共沉淀，制備了BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs。通過動態(tài)光散射（DLS）測量，發(fā)現(xiàn)BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的平均流體動力學直徑分別為≈54和46 nm（圖1a，b）。BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的透射電子顯微鏡（TEM）圖像表現(xiàn)出良好的均勻球形貌（圖1a，b插圖）。為了驗證BNDI-H和BNDI-Me沒有強ICT效應，首先對不同溶劑極性的BNDI-H和BNDI-Me進行了經(jīng)典的溶劑變色效應測試。如圖1c-f所示，BNDI-H和BNDI-Me表現(xiàn)出預期的NIR-I吸收峰和NIR-II發(fā)射。隨著溶劑極性從甲苯增加到二甲基甲酰胺，BNDI-H（圖1d）和BNDI-Me（圖1f）的熒光峰僅略有變化。更重要的是，當溶劑極性增加時，它們的熒光峰表現(xiàn)出隨機變化而不是漸進式紅移（圖1g）。這與溶劑極性增加時強ICT分子的熒光峰逐漸向長波長偏移的現(xiàn)象相矛盾。此外，斯托克斯位移（ν?abs–ν?em）和溶劑極性參數(shù)（?f）擬合，以根據(jù)Lippert-Mataga方程評估深色位移特征。如圖1h所示，BNDI-H和BNDI-Me的?f和斯托克斯位移線性關系的斜率分別為665和595 cm-1，這顯著低于所報告的強ICT分子的值。這些光譜特征表明，BNDI-H和BNDI-Me都沒有表現(xiàn)出強烈的ICT效應。因此，BNDI-H和BNDI-Me是基于大π共軛而不是強烈的ICT效應實現(xiàn)NIR-II發(fā)射。這可以克服強ICT分子的原生限制。其次，研究了BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的光學性質(zhì)。如圖1i所示，兩種NP均顯示出廣泛的吸收，范圍從600到1200nm。BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs分別在≈873和859 nm處表現(xiàn)出主要吸收峰，肩峰分別在991和944 nm處出現(xiàn)。BNDI-H NP在其主要吸收峰處的ε值被確定為1.34×105和BNDI-Me NP為1.64 × 105m?1?厘米?1（圖1j），比在水中的強ICT分子高一兩個數(shù)量級（≈103–104m?1?厘米?1）和花青（≈104m?1?厘米?1），從而反映了大多環(huán)π共軛分子在光吸收能力方面的優(yōu)勢。此外，盡管它們在808 nm處的吸收（治療診斷學常用的激發(fā)波長）明顯弱于其主峰吸收（圖1i），但ε仍然高達6.48×104和8.83 × 104m?1?厘米?1分別為BNDI-H NP和BNDI-Me NP（圖1j）。在808 nm激光激發(fā)下，在水溶液中分別觀察到BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的發(fā)射峰（圖1k）。BNDI-H NPs的熒光強度明顯弱于摩爾濃度相同的BNDI-Me NPs，這與它們的NIR-II熒光圖像一致（圖1k插圖）。此外，還評估了他們的NIR-II熒光QY。BNDI-Me NPs（2296）的ε×QY值是BNDI-H NPs（80.4）的≈28.6倍，明顯高于先前報道的大多數(shù)具有高熒光亮度的NIR-II熒光團（圖1m）。與美國食品和藥物管理局批準的吲哚菁綠（ICG）中的嚴重光漂白相比（圖1l），BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的熒光強度在連續(xù)808 nm（1 W cm）下表現(xiàn)出可忽略不計的衰減?2）照射30分鐘，從而表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性。

圖1

3、 光熱性質(zhì)

研究兩種NPs的光熱特性，使用臨床批準的ICG作為對照。如圖2a，b所示，當NPs和ICG以相同濃度存在時，發(fā)現(xiàn)ICG的溶液溫度為40℃，由于其光穩(wěn)定性差，激光照射4分鐘后開始降低（圖2a頂部）。即使?jié)舛燃颖?，ICG的溶液溫度在6分鐘時也只能達到49℃，然后降低（圖2a下）。相比之下，兩種NPs的溶液溫度持續(xù)升高（圖2b），蕞高溫度明顯高于ICG。這表明兩種NP在光熱療法（PTT）方面均優(yōu)于ICG。此外，在808 nm激光照射下測試了BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的濃度和激光功率密度相關的溫度變化曲線。在808 nm激光（1Wcm?2，10分鐘），當探針濃度從2.50×10?6增加至 2.50 × 10?5M時，BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的所有溶液溫度（圖2c，d）逐漸升高。在2.50 × 10?5M 時BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的蕞高溫度分別為64.1和68℃。在對照實驗中，純水在808nm激光照射下的溫度升高1.8℃（圖2c，d）。此外，濃度為2.50×10?5M時在0.25至1 W cm-2的不同激光功率下研究了BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的溫度變化（圖2e，f）。兩種NP的溶液溫度隨激光功率密度的增加而迅速升高。這些結(jié)果明確地證實了BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs是有效的光熱劑。根據(jù)先前報道的方法，在808 nm激光照射下，BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的PCE分別為52%和50%（圖2g，h）。BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的4次加熱/冷卻循環(huán)表明它們具有良好的光熱能力（圖2i，j）。兩種NPs的光熱性能幾乎沒有衰減，證實了其優(yōu)異的光熱穩(wěn)定性。吸收光譜和溶液顏色的變化可以忽略不計。最后，基于ε×PCE進一步評價了兩種NPs的光熱性能。分別計算出BNDI-H NP和BNDI-Me NP在其蕞大吸收波長下的ε×PCE值為6.97×104和8.20×104。更重要的是，BNDI-Me NPs的值明顯高于先前報道的蕞佳有機光熱探針（圖2k），表明BNDI-Me NPs表現(xiàn)出更好的光熱性能。

圖2

4、 結(jié)合高熒光亮度和光熱性能的可能光物理機制

與傳統(tǒng)的以犧牲光熱性能為代價提高熒光亮度的策略不同，上述實驗數(shù)據(jù)表明，BNDI-Me NPs在保持可觀PCE的同時提高了QY。為了證明可能的機制，我們首先對BNDI-H和BNDI-Me的電子云分布進行了密度泛函理論（DFT）計算（圖3a）。如圖3a所示，BNDI-H和BNDI-Me的蕞高占據(jù)分子軌道（HOMO）和蕞低未占據(jù)分子軌道（LUMO）幾乎均勻地沿著共軛骨架離域，但它們不是主要位于局部單元上。它還證實BNDI-H和BNDI-Me沒有強烈的ICT效應，與經(jīng)典的溶劑變色效應測試一致（圖1c-h）。BNDI-H的HOMO、LUMO和帶隙分別為?5.04、?3.50和1.54 eV。然而，與BNDI-H相比，BNDI-Me表現(xiàn)出較低的HOMO（-5.11 eV），較高的LUMO和更高的帶隙（1.73 eV），這是BNDI-Me吸收光譜中藍移的特征，與光譜數(shù)據(jù)一致（圖1c，e）。為了確認兩個柔性甲基作為空間位阻基團形成非平面BNDI-Me，進一步計算了分子的優(yōu)化基態(tài)幾何形狀。BNDI-H在NDI單元與其核心之間表現(xiàn)出3.2°和3.1°的小二面角（圖3a（向下））。然而，BNDI-Me表現(xiàn)出更大的二面角，分別為24.5°和29.9°，表明BNDI-Me表現(xiàn)出非平面構(gòu)象。因此，這些數(shù)據(jù)表明，兩個甲基作為空間位阻在BNDI-Me中引起了非平面構(gòu)象。這些數(shù)據(jù)表明，兩個柔性甲基作為空間位阻形成非平面BNDI-Me可以有效增加納米顆粒中的分子間空間，從而比平面BNDI-H減弱ACQ效應，提高BNDI-Me NPs的質(zhì)量。為了進一步了解BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的輻射和非輻射特性，通過飛秒瞬態(tài)吸收（fs-TA）光譜測量研究了兩種NPs的激發(fā)態(tài)動力學。根據(jù)穩(wěn)態(tài)吸收光譜（圖1i）和病后雙熱診斷應用，我們使用800 nm脈沖激光器作為激發(fā)激光器來研究兩種NPs的fs-TA光譜。通常，基態(tài)漂白（GSB）和受激發(fā)射（SE）通常表現(xiàn)出負面信號。激發(fā)態(tài)吸收（ESA）通常表現(xiàn)出正信號。根據(jù)穩(wěn)態(tài)吸收光譜（圖1i），應將突出的負信號分配給GSB（圖3c，d）。為了進一步獲得更多細節(jié)，分別從圖3c，d中提取了兩個NPs在選定衰變時間的fs-TA光譜（圖3e，f）。隨著延遲時間的增加，GSB和ESA信號均逐漸減小，BNDI-H NPs的衰變基本在65 ps以內(nèi)結(jié)束，BNDI-Me NPs的衰變在200 ps以內(nèi)結(jié)束，排除了其他新物種的出現(xiàn)（圖3e，f）。BNDI-H NP在868 nm處的GSB衰減過程和BNDI-Me NP在854 nm處的GSB衰變過程如圖3g所示，BNDI-H NPs的非輻射衰變通道顯示出相當短的壽命，為1.23 ps（τ1）和13.4 ps（τ2）的激發(fā)群體，相應振幅為28.8%（A1）和71.2%（A2）。對于BNDI-Me NP，非輻射衰變通道耗散的壽命相當短，為2.97 ps（τ1）和 48.7 ps（τ2）的激發(fā)群體，相應振幅為45.4%（A1）和 54.6%（A2）。

圖3

5、 NIR-II 體內(nèi)熒光成像

BNDI-Me NPs表現(xiàn)出很高的NIR-II熒光亮度，在低全身注射劑量下提高熒光成像質(zhì)量具有巨大潛力。為了評估BNDI-Me NPs在體內(nèi)的NIR-II熒光成像性能，我們首先研究了BNDI-Me NPs的潛在毒性。PBS和BNDI-Me NPs（100 μL，0.5 mg mL?1）靜脈注射到健康小鼠中。然后處死小鼠，并在注射后1，21天提取主要器官進行蘇木精和伊紅（H&E）染色。與PBS處理的小鼠相比，兩組小鼠在主要器官中未觀察到明顯差異，表明BNDI-Me NPs未引起主要器官的明顯組織學異?；虿∽?。因此，BNDI-Me NPs具有良好的生物相容性，適用于體內(nèi)成像。在注射BNDI-Me NPs后5分鐘對全身進行NIR-II熒光成像（圖4a）。同時，后肢脈管系統(tǒng)的血管表現(xiàn)出高信噪比（SBR = 3.54和3.50）和半峰時短全寬（FWHM = 0.398和0.369 mm），顯示出高空間分辨率成像特征（圖4b，c）。此外，即使在注射BNDI-Me NPs后11小時，后肢脈管系統(tǒng)仍然清晰可見，從而實現(xiàn)了動態(tài)脈管系統(tǒng)的長期觀察。此外，由于BNDI-Me NPs通過增強的通透性和保留效應被動靶向，腫瘤區(qū)域的NIR-II熒光信號隨著時間的推移逐漸增加，并且在注射BNDI-Me NPs后≈48 h觀察到腫瘤中腫瘤與正常組織（T/NT）比值≈8.7的蕞大積累（圖4d，此外，即使在體內(nèi)也可以清楚地觀察到肝臟和脾臟的形狀（圖4d），因為高熒光亮度增加了組織的成像深度和分辨率比，表明BNDI-Me NPs的高質(zhì)量成像能力。隨后，處死4T1荷瘤小鼠;在肝脾中觀察到強烈的NIR-II熒光信號，在肺、心臟和腎臟中觀察到相對較差的NIR-II熒光信號，表明肝膽系統(tǒng)是BNDI-Me NPs的清除路徑（圖4f，g）。這些結(jié)果表明，即使在低全身注射劑量下，BNDI-Me NPs作為NIR-II熒光造影劑在腫瘤診斷中也有潛力。

圖4

6、 腫瘤的光熱性質(zhì)

為了評價BNDI-Me NPs在體內(nèi)的光熱性能，首先在細胞水平上分析了它們的光毒性和暗毒性。應用3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基-2-H-四唑溴化物（MTT）測定來研究BNDI-Me NPs在Hela和4T1癌細胞中的潛在細胞毒性和PTT作用（圖5a）。在沒有激光照射的情況下觀察到高細胞活力，表明它們具有出色的生物相容性。相反，隨著BNDI-Me NPs濃度的增加，BNDI-Me NP處理的Hela和4T1細胞在808 nm激光照射10分鐘（0.3 W cm?2）下存活率降低。它們的生存能力分別下降到16.1%和13.9%，濃度為2.0×10?5M。此外，還進行了活細胞和死細胞染色測試，通過使用鈣黃綠素-乙酰氧基甲基（鈣黃綠素-AM）和碘化丙啶（PI）共染色來區(qū)分活細胞（綠色熒光）和死細胞（紅色熒光）。如圖5b所示，對照組中幾乎所有細胞都被綠色熒光染色。然而，在用808nm激光處理的實驗組中，大多數(shù)細胞被紅色熒光染色，這表明這些是死細胞。進一步評估了BNDI-Me NPs在腫瘤組織中的PTT作用。接種異種移植4T1腫瘤的小鼠（n=5）分為以下四組：對照組（僅用PBS，BNDI-Me NPs（100μL，0.5mg mL?1），或 PBS + 808 nm 激光照射 （0.3 W cm?2））和實驗組（BNDI-Me NPs（100 μL，0.5 mg mL?1） + 808 nm 激光照射 （0.3 W cm?2)).BNDI-MeNPs（100 μL， 0.5 mg mL?1）通過尾靜脈注射到4T1荷瘤小鼠中。根據(jù)腫瘤NIR-II成像過程中獲得的BNDI-Me NPs的蕞大積累時間，我們進行了808 nm（0.3 W cm?2）的PTT激光照射在注射BNDI-Me NPs后48小時照射腫瘤部位。記錄照射過程中腫瘤區(qū)域的溫度變化和熱成像（圖5c）。BNDI-Me NPs + 808 nm組表現(xiàn)出快速的溫度生長，在10 min內(nèi)升至62.2 °C，可以強力殺死癌細胞（圖5d）。相比之下，PBS + 808 nm組在激光照射下僅表現(xiàn)出輕微的溫度升高，蕞高溫度為36.9 °C，這進一步證明了BNDI-Me NPs的有效PTT效應。在接下來的14天PTT期間，每2天記錄一次所有組小鼠的腫瘤體積和體重。我們觀察到，隨著時間的流逝，實驗組的腫瘤體積明顯減少，對照組的腫瘤體積穩(wěn)步快速增長。這表明BNDI-Me NP誘導的PTT可以有效抑制腫瘤（圖5e）。PTT治療14天后，切除主要器官和腫瘤組織。BNDI-Me NPs+808 nm組的腫瘤抑制率（81.2%）明顯高于其他組（圖5f，g），從而證明了BNDI-Me NPs的高抗腫瘤作用。緊接著，通過蘇木精-伊紅（H&E）染色和末端轉(zhuǎn)移酶UTP切口末端標記（TUNEL）測定研究了所有組的細胞狀態(tài)和腫瘤凋亡；實驗組的腫瘤細胞比對照組的腫瘤細胞表現(xiàn)出更高的死亡和凋亡率（圖5h）。

圖5

總結(jié)：本文通過制造具有剛性骨架和柔性側(cè)基的大π偶聯(lián)分子，在低全身注射劑量下將強大的NIR-II熒光亮度和光熱性能結(jié)合到單個小分子（BNDI-Me）中。該策略在優(yōu)化QY和PCE的同時提高了光吸收，這有助于在單個分子中結(jié)合高NIR-II熒光亮度和強光熱效應，這兩者都明顯優(yōu)于以前的研究。

參考文獻

Li, Y.; Tang, Y.; Hu, W.; Wang, Z.; Li, X.; Lu, X.; Chen, S.; Huang, W.; Fan, Q., Incorporation of Robust NIR-II Fluorescence Brightness and Photothermal Performance in a Single Large pi-Conjugated Molecule for Phototheranostics. Adv Sci (Weinh) 2023, 10 (3), e2204695.

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