本文要點：高空間分辨率、低背景和深層組織穿透力使近紅外II（NIR-II）熒光成像成為體內(nèi)觀察和測量的最關鍵工具之一。然而，合成NIR-II熒光團相對較短的保留時間和潛在的毒性限制了其長期應用。本文報告了紅外熒光蛋白（iRFP）作為體外和體內(nèi)NIR-II探針的使用，允許長時間的連續(xù)成像（長達15個月）。作為一個代表性的例子，將iRFP713敲入小鼠基因組以產(chǎn)生一個轉(zhuǎn)基因模型，允許探針在時間和/或空間表達控制。為了證明其在真正的診斷環(huán)境中的可行性，采用了兩種肝臟再生模型，并成功跟蹤了一周的過程。性能和監(jiān)測效果與μCT相當，優(yōu)于吲哚菁綠染料。盡管胰腺的位置很深，但也能有效地觀察到生理和病理條件下的胰腺。這些結果表明，iRFP輔助的NIR-II熒光系統(tǒng)適用于監(jiān)測各種組織和體內(nèi)生物過程，提供了一個強大的wu創(chuàng)長期成像平臺。

背景：熒光成像是在活體結構和功能研究中應用zui廣泛的技術之一。使用第二近紅外區(qū)域(NIR-II, 900-1880nm)成像能夠以令人印象深刻的清晰度直接可視化和實時監(jiān)測深層生物結構和過程。迄今為止，稀土摻雜納米顆粒(RENPs)，量子點(QDs)和某些有機熒光染料已被開發(fā)用于多功能生物醫(yī)學成像中的NIR-II熒光探針。然而，由于它們是化學合成的，這些探針受到嚴重的限制，包括它們在生命系統(tǒng)中bu可再生，并可能存在潛在的生物毒性風險。在細胞分裂過程中，這種探針在兩個子細胞之間的分割將導致信號衰減，導致在多次細胞復制后探針不再被檢測到。此外，合成探針可以通過體內(nèi)的生物過程快速分解或消除，根據(jù)類型，外源性熒光探針可能表現(xiàn)出一定程度的細胞毒性。因此，這些探頭不適用于長時間成像。作為一種替代且更具生物相容性的選擇，熒光蛋白（FPs）在長期監(jiān)測中比化學合成探針具有很大的優(yōu)勢。已報道了多條近紅外FP線。其中，紅外熒光蛋白（iRFP）系列，包括iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP713和iRFP720，在近紅外波長下具有發(fā)射和激發(fā)光譜。iRFP是杜鵑假單胞菌細菌植物色素的工程版本，可實現(xiàn)wu創(chuàng)和長期體內(nèi)可視化。然而，到目前為止，只有NIR-I區(qū)域被開發(fā)。為了探索iRFP在NIR-II區(qū)域的應用，本文研究證明了iRFP713通過非峰值熒光發(fā)射進行NIR-II生物成像具有較高的時間和空間分辨率，具有長期監(jiān)測能力，可作為各種內(nèi)部生物過程成像的強大平臺。

研究內(nèi)容：

圖1

2、iRFP713的NIR-II體內(nèi)成像

本文采用基于CRISPR/ Cas9的基因組編輯技術將iRFP713基因敲入小鼠內(nèi)源性Rosa26位點(iRFP713flox/flox)。具體來說，是將一個lox-stop-lox (LSL)元件放置在iRFP713前面，跟隨CAG啟動子，防止iRFP713的表達，除非引入Cre重組酶去除停止盒?；蚍中头治鲎C實成功構建了所需的轉(zhuǎn)基因小鼠。在與不同組織特異性Cre系的iRFP713flox/flox小鼠雜交后，通過Cre介導的重組，位于兩個lox位點兩側的停止元件可以被刪除或倒置，導致iRFP713僅在表達Cre的組織中被激活。因此，使用該技術，本文建立一個組織特異性表達irfp713的轉(zhuǎn)基因小鼠(圖2a)。為了評估其成像能力，本文生成了一個全身表達iRFP713的小鼠(iRFP713flox/flox;Ella-Cre)通過將iRFP713flox/flox鼠標與EIIa-Cre系雜交。在確認對小鼠沒有明顯的副作用或健康問題后，我們檢查了所需后代的熒光特性。與對照組(iRFP713flox/flox)相比，iRFP713flox/flox；EIIa-Cre小鼠的整個身體表現(xiàn)出明亮的NIR-II熒光（圖2b）。進一步檢測了表達iRFP713的小鼠在出生后1、3和8周甚至15個月的熒光。結果表明，通過NIR-II成像，可以在所有這些時間點清楚地檢測到iRFP713熒光信號（圖2bc）。此外，我們能夠區(qū)分某些器官的邊界，例如肝臟，并從不同角度觀察內(nèi)部組織的細節(jié)（圖2c）。此外，我們對離體器官進行了體外NIR-II熒光成像（圖2d）。不同器官的熒光強度各不相同，從腎臟和胃的熒光強度zui低，心臟、肺和胰腺的熒光強度較高，肝臟中熒光強度zui高（圖2de）。這些數(shù)據(jù)共同表明，基于iRFP713的NIR-II熒光成像可以作為wu創(chuàng)組織觀察的平臺。

圖2

3、體內(nèi)肝臟再生實時追蹤

為了測試我們的成像系統(tǒng)是否具有長期觀察活體生物過程的潛力，我們使用肝臟再生作為監(jiān)測模型。為了防止肝臟以外的非靶組織對iRFP713熒光的干擾，比如在表達iRFP713的全身小鼠中，我們認為開發(fā)一種表達iRFP713的肝細胞特異性動物更合適。為此，我們將iRFP713flox/flox小鼠與Alb-Cre系雜交，其中Cre重組酶受Alb啟動子控制，使Cre只在肝細胞中表達(圖3a)。與預期的一樣，幼(8周)和大(15個月)的iRFP713flox/flox; Alb-Cre小鼠的肝臟都可以通過NIR-II熒光清晰可見，而對照組沒有顯示任何熒光（圖3b）。接下來，我們在iRFP713flox/flox;Alb-Cre小鼠中建立了部分肝切除術(PHX)模型以監(jiān)測肝臟再生過程。在該模型中，大約三分之二的肝臟被手術切除，然后肝臟在7 - 10天內(nèi)通過肝細胞的增殖恢復到原來的質(zhì)量(圖3c)。如圖3d所示，當從右側觀察時，NIR-II熒光成像能夠清楚地分辨PHX小鼠中包含三個部分（中葉，左葉和右葉）的正常“冠狀"形狀，并能看到切除中葉和左葉后殘余肝臟。熒光的面積和強度從第1天到第7天逐漸增加，肝臟相應恢復和再生。為了提供參考標準，我們還通過造影劑增強μCT定量測量了殘余肝體積，這在臨床環(huán)境中通常用于肝臟診斷μCT分析顯示，切除術后肝容量顯著增加，第5天和第7天分別為191.0%±35.0%和218.3%±53.8%（圖3d）。然后，我們估計了μCT肝臟測量數(shù)據(jù)與iRFP713輔助NIR-II熒光成像的相關性。iRFP713熒光面積數(shù)據(jù)與μCT測量的體積（R2= 0.9595，p< 0.01）（圖3d），表明我們的系統(tǒng)在小鼠肝臟可視化方面可與經(jīng)典的μCT相媲美。吲哚菁綠（ICG）是一種臨床批準的安全熒光染料，用于肝臟研究和近紅外熒光成像。為了比較iRFP713和這種染料的性能，我們在PHX模型中使用ICG進行了NIR-II成像。與iRFP713不同，我們必須在每次觀察之前通過尾靜脈單獨給予ICG。ICG輔助成像沒有提供清晰的肝臟與其他組織對比，因為染料被迅速代謝并且無法特異性地積聚在肝臟中（圖3e）。我們還采用了經(jīng)典的化學肝損傷模型，對乙酰氨基酚（APAP）驅(qū)動的肝臟再生，評估iRFP713和ICG的可視化功能。iRFP713輔助成像顯示，由于APAP誘導的肝細胞死亡，肝臟熒光強度在第1天下降了62.8%（圖3f），但在第2天和第3天分別增加了17.4%和35.1%（圖3f）。這種“先跌后升"的現(xiàn)象與急性肝損傷的病理過程一致，急性肝損傷表現(xiàn)出明顯的損傷和消退階段。然而，在基于ICG的成像中沒有觀察到顯著變化（圖3f）。

圖3

4、胰腺的wu創(chuàng)長期可視化

胰腺作為位于深部的器官之一，兼具內(nèi)分泌和外分泌功能，與糖尿病和胰腺炎等常見疾病過程明顯相關。為了測試我們的系統(tǒng)如何在這種深層組織中工作，我們將iRFP713flox/flox與Pdx1-Cre品系雜交，生成胰腺特異性iRFP713表達的小鼠 (iRFP713flox/flox;Pdx1-Cre)（圖4a）。在NIR-II成像下，無論小鼠是年輕（8周）還是老年（15個月），胰腺中的熒光清晰，而它們的對照組則缺乏任何明顯的NIR-II熒光信號（圖4b）。然后，我們通過在剖腹手術期間在充滿液體的胰腺和分離的胰腺中檢測來自胰腺內(nèi)部的熒光信號，在這只轉(zhuǎn)基因小鼠中確認了胰腺特異性iRFP713熒光(圖4c)。為了驗證病理條件下的胰腺成像能力，我們首先使用鏈脲佐菌素（STZ）生成糖尿病模型。在這里，iRFP713fiox/flox;Pdx1-Cre小鼠被施予多種低劑量的STZ以誘導胰腺β細胞衰竭和死亡。然后，我們在不同的時間點進行了NIR-II熒光成像。如圖4d所示，胰腺的熒光信號在STZ注射后第1、3、5和7天略有下降，但差異無統(tǒng)計學意義（圖4d）。我們認為這主要是因為整個胰腺中表達iRFP713的β細胞百分比低。為了應對這一挑戰(zhàn)，我們給小鼠施用蔚藍素以誘導急性胰腺炎（圖4e）。在該模型中，胰腺腺泡細胞（主要的表達iRFP713的細胞）是天青素的靶標。影像學結果顯示，腹腔注射天青素1天后，iRFP713熒光顯著下降，隨后隨著胰腺從急性胰腺炎中恢復，熒光顯著升高（圖4f）。這些數(shù)據(jù)表明，胰腺特異性iRFP713的NIR-II成像可用于監(jiān)測生理和病理條件下的胰腺。

圖4

總結：通過使用蛋白質(zhì)iRFP713作為探針，我們開發(fā)了一種生物相容性和可再生體內(nèi)NIR-II監(jiān)測方法，具有深度穿透性和高成像對比度。該平臺不僅適用于準備組織特異性表達時的單組織觀察，而且還能夠?qū)崿F(xiàn)任何器官的長期可視化。我們相信，該平臺可以作為長期監(jiān)測許多活體生物過程的有力工具。

參考文獻

doi.org/10.1038/s41467-022-34274-w

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近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀

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 恒光智影

          上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，被評為上海市"科技創(chuàng)新行動計劃"科學儀器領域立項單位。

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