動脈粥樣硬化是一種大動脈疾病，其發(fā)病機制的起始步驟是血管內(nèi)皮屏障功能障礙。覆蓋在內(nèi)皮細(xì)胞表面的糖萼是維持內(nèi)皮和血管功能的非常關(guān)鍵的“器官"。越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)皮糖萼不完整性導(dǎo)致血管系統(tǒng)對致動脈粥樣硬化和炎癥的敏感性增加。作為糖萼的主要成分，透明質(zhì)酸（HA）可以微調(diào)細(xì)胞行為，能監(jiān)測和放大內(nèi)皮細(xì)胞膜上的流動引起的剪切應(yīng)力。

活性氧（ROS）不僅對糖萼構(gòu)成直接威脅，而且還可以通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和內(nèi)源性蛋白酶抑制劑的失活來增強糖萼的蛋白水解，可以降解膠原蛋白，透明質(zhì)酸和層粘連蛋白，所有這些都是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要組成部分，導(dǎo)致糖萼層的根本破壞。

低剪切應(yīng)力（LSS）會導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生過多，超過系統(tǒng)的局部抗氧化能力，進而導(dǎo)致糖萼降解。顯然，低剪切應(yīng)力刺激和氧化應(yīng)激之間存在惡性循環(huán)，兩者協(xié)同作用可能會使糖萼退化。但是，低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙的發(fā)病機制在很大程度上仍不清楚。

小檗堿（BBR）也叫黃連素，是從中藥黃連中分離出來的一種生物堿，具有多種藥理和生物學(xué)活性，例如抗菌活性、抗炎、抗氧化應(yīng)激和心臟保護作用。先前的研究表明，低剪切應(yīng)力通過增加p47 ^phox的磷酸化以及增加的活性氧產(chǎn)生來損害糖萼。然而，低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的糖萼降解和小檗堿之間的相互作用，以及小檗堿對低剪切應(yīng)力損傷的內(nèi)皮的保護作用的機制，仍然未知。

因此，江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科、南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科、揚州大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科的一項聯(lián)合研究旨在探索小檗堿是否減弱了細(xì)胞和動物模型中低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的糖萼降解，并闡明了潛在的分子機制。

小檗堿改善低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸降解

低剪切應(yīng)力可以促進透明質(zhì)酸的降解，其降解可以促進炎癥反應(yīng)。相反，小檗堿已被證明在抑制炎癥方面起著關(guān)鍵作用。因此，實驗決定確定小檗堿是否參與透明質(zhì)酸代謝的調(diào)節(jié)。首先，將HUVECs暴露在設(shè)置的時間（0、5、15、30、60和120 min）的低剪切應(yīng)力（2?dyne/cm2）下。免疫熒光分析顯示，透明質(zhì)酸表達(dá)明顯降低，在暴露于低剪切應(yīng)力30 min時達(dá)到最小值（圖1）。其次，用不同劑量（0、5 μmol/l、10 μmol/l和20 μmol/l）對HUVECs進行預(yù)處理24 h，然后暴露于低剪切應(yīng)力下，結(jié)果表明，小檗堿降低了低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸降解，且呈濃度依賴性（圖1 B）。

為了確定小檗堿降低體外透明質(zhì)酸降解的作用是否可以轉(zhuǎn)化到小鼠模型，通過免疫熒光測量了透明質(zhì)酸的表達(dá)并量化了IHC載玻片。結(jié)果表明，與對照組相比，小檗堿處理顯著恢復(fù)了主動脈血管組織中透明質(zhì)酸的表達(dá)（圖1 C、D）。

圖1   小檗堿改善低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的HA降解

小檗堿抑制低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的NADPH氧化酶激活

作為活性氧的主要來源，NADPH-氧化酶在血管細(xì)胞糖萼的代謝中起著至關(guān)重要的作用。以前的研究表明，低剪切應(yīng)力和小檗堿對NADPH氧化酶的活性具有相反的影響，其中低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)NADPH氧化酶激活，而小檗堿抑制NADPH氧化酶活化。在這項研究中，證實了低剪切應(yīng)力可以提高p47phox的磷酸化水平并在體外激活NADPH 氧化酶 2（NOX2）。此外，還顯示低剪切應(yīng)力下內(nèi)皮細(xì)胞中p47phox的磷酸化水平顯著高于靜態(tài)組。免疫共沉淀分析表明，低剪切應(yīng)力增加了p47phox和NOX2的結(jié)合，這可能導(dǎo)致NADPH氧化酶的活化。然而，用小檗堿預(yù)處理后，p47phox磷酸化和NOX2活化都受到抑制，p47phox和NOX2的結(jié)合也在體外降低，伴隨著活性氧產(chǎn)生的減少。

有趣的是，小檗堿處理導(dǎo)致p47phox 的基礎(chǔ)磷酸化水平升高，但與對照組相比，當(dāng)暴露于低剪切應(yīng)力時，這種變化沒有進一步增加。小檗堿處理組和對照組的活性氧和NO的基礎(chǔ)水平都沒有明顯變化。同樣，小檗堿不僅不增加細(xì)胞凋亡，而且還減少低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

小檗堿抑制LSS誘導(dǎo)的Hyal2激活并調(diào)節(jié)p47phox和 Hyal2的串?dāng)_

作為調(diào)節(jié)HA代謝的主要酶，透明質(zhì)酸氨基葡糖苷酶2（Hyal2）在HA消化中起著至關(guān)重要的作用。體外蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光均顯示，暴露于低剪切應(yīng)力后，Hyal2表達(dá)顯著增加（圖2 B、E）。為了確定小檗堿是否也與Hyal2的激活有關(guān)，用小檗堿（5μM、10μM、20μM）預(yù)處理細(xì)胞24小時，然后暴露于低剪切應(yīng)力。蛋白質(zhì)印跡顯示，小檗堿抑制Hyal2活化（圖2 C、D），免疫熒光分析也證明小檗堿可以降低Hyal2表達(dá)（圖2 E）。與p47phox磷酸化的變化類似，體內(nèi)小檗堿預(yù)處理后Hyal2表達(dá)也降低（圖2 A）。

此外，發(fā)現(xiàn)p47phox沉默后，小檗堿未能進一步抑制低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的Hyal2激活，表明小檗堿通過調(diào)節(jié)p47phox抑制Hyal2的活性。同樣，當(dāng) p47phox過表達(dá)時，小檗堿不能有效抑制Hyal2活化；當(dāng)Hyal2沉默時，小檗堿也不能抑制低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 p47phox 磷酸化。此外，發(fā)現(xiàn)小檗堿可以增加p47phox/Hyal2 的結(jié)合。

圖2   小檗堿抑制LSS誘導(dǎo)的Hyal2激活

小檗堿逆轉(zhuǎn)低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的AMPK去磷酸化

研究表明，小檗堿對糖尿病和肥胖癥有益，至少部分是通過調(diào)節(jié)AMPK活性。因此，假設(shè)小檗堿可能會逆轉(zhuǎn)低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的AMPK磷酸化水平降低。圖3 A表明，低剪切應(yīng)力降低了AMPK的磷酸化水平。用小檗堿預(yù)處理后，可以逆轉(zhuǎn)低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的AMPK去磷酸化（圖3 C）。為了證明小檗堿激活AMPK的功效，用不同濃度的小檗堿（5μM、10μM、20μM）預(yù)處理HUVECs 24小時，然后暴露于低剪切應(yīng)力。蛋白質(zhì)印跡顯示，小檗堿可以以劑量依賴性方式顯著增加AMPK的磷酸化水平（圖3 B）。

圖3   小檗堿通過逆轉(zhuǎn)低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 AMPK 抑制抑制p47phox和 Hyal2 激活

小檗堿通過AMPK活化抑制HUVECs中p47phox 磷酸化和Hyal2活化

考慮到小檗堿恢復(fù)了低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的AMPK去磷酸化，實驗試圖確定小檗堿是否通過激活 AMPK減弱低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的p47phox磷酸化和 Hyal2 活化。結(jié)果表明，在與小檗堿和化合物C（AMPK抑制劑）共同處理后，低剪切應(yīng)力可以消除p47phox和Hyal2對小檗堿的響應(yīng)（圖3 D）。為了進一步在小檗堿處理中連接 AMPK 與 p47phox和Hyal2，通過敲低AMPKα1，然后用小檗堿預(yù)處理24小時，在低剪切應(yīng)力下，小檗堿不能抑制p47phox磷酸化和Hyal2活化（圖3 E-G）。此外，實驗確定了p47phox和Hyal2的結(jié)合是否也受到小檗堿處理的影響。結(jié)果表明，小檗堿降低了低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的p47phox/Hyal2 的解離（圖3 H）。所有數(shù)據(jù)都顯示，小檗堿通過 AMPK 激活抑制p47phox和 Hyal2的活化。

小檗堿逆轉(zhuǎn)HAS2的表達(dá)也依賴于AMPK活化

透明質(zhì)酸合酶-2（HAS2）是合成透明質(zhì)酸的關(guān)鍵酶。在這項研究中，蛋白質(zhì)印跡顯示，低剪切應(yīng)力以時間依賴性方式下調(diào)HAS2表達(dá)，30min時HAS2表達(dá)最小。然而，小檗堿可以改善低剪切應(yīng)力降低的HAS2表達(dá)，且呈劑量依賴性。

為了研究低剪切應(yīng)力降低HAS2表達(dá)的潛在機制至少部分是由于AMPK活性的變化，實驗用小檗堿和化合物C共同處理細(xì)胞，然后暴露于低剪切應(yīng)力。蛋白質(zhì)印跡顯示，小檗堿處理不能逆轉(zhuǎn)HAS2表達(dá)的降低，表明AMPK參與了HAS2表達(dá)的調(diào)節(jié)。此外，在敲低AMPKα1的同時，HAS2表達(dá)的變化也不受小檗堿處理的影響。相反，通過過表達(dá)AMPKα1然后暴露于低剪切應(yīng)力，與對照組相比，HAS2表達(dá)顯著增加。這些結(jié)果表明，小檗堿通過AMPK通路調(diào)節(jié)HAS2活性。

然而沒有發(fā)現(xiàn)AMPK和HAS2之間的直接聯(lián)系。因此，測試了p47phox 是否參與HAS2的介導(dǎo)。用p47phox siRNA轉(zhuǎn)染時，低剪切應(yīng)力不能顯著降低HAS2的表達(dá)。因此，低剪切應(yīng)力通過AMPKα/p47phox 通路誘導(dǎo)HAS2表達(dá)的變化。

總之，小檗堿調(diào)節(jié)低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸降解不僅抑制了p47phox 和Hyal2活性，也增強了HAS2的表達(dá)。

圖4   BBR介導(dǎo)透明質(zhì)酸代謝作用的示意圖

BBR可以逆轉(zhuǎn)LSS誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸損傷。該過程可能是通過調(diào)節(jié)AMPK活化，然后減少p47phox的磷酸化和 Hyal2 激活。此外，BBR還減弱了LSS誘導(dǎo)的HAS2失活。同樣，HAS2的表達(dá)也受到AMPK活性的調(diào)節(jié)。因此，合成和分解代謝均受BBR調(diào)節(jié)。

總之，該研究表明，小檗堿處理可以通過增加AMPKa的磷酸化來減弱低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸降解，進而下調(diào) p47phox和Hyal2活性，并上調(diào)HAS2的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)：Yang H, Zhu L, Gu Y, Kong X, Yan Liu, Chen M, Xie X, Luo J, Chen S. Berberine inhibits low shear stress-induced glycocalyx degradation via modulating AMPK and p47phox/Hyal2 signal pathway. Eur J Pharmacol. 2019 Aug 5;856:172413. doi: 10.1016/j.ejphar.2019.172413. Epub 2019 May 29. PMID: 31152700.

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