由于其成骨誘導(dǎo)的特性，基于干細(xì)胞的骨再生療法有望改善臨床中的骨愈合。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）具有無(wú)限的增殖能力，可以作為體外組織工程的干細(xì)胞庫(kù)。此外，iPSCs具有多能性和自組織潛力，可以分化成三個(gè)胚層（內(nèi)胚層、中胚層、外胚層），并且可以在不使用支架的情況下形成三維（3D）組織或器官。因此，iPSCs可能是骨組織工程的一個(gè)有希望的來(lái)源。但iPSCs的成骨分化需要更大的刺激來(lái)引導(dǎo)足夠的iPSC分化為成骨細(xì)胞。

機(jī)械刺激，特別是那些來(lái)自剪切力、壓縮力和拉伸力的刺激，在胚胎發(fā)生/器官發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮作用。先前的研究表明，剪切應(yīng)力以不同的方式增強(qiáng)了間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的成骨分化，這取決于施加的剪切力的大小、持續(xù)時(shí)間和頻率。然而，對(duì)這種現(xiàn)象背后的機(jī)制知之甚少。

類器官技術(shù)的趨勢(shì)，以及再生醫(yī)學(xué)骨組織工程的趨勢(shì)，依賴于iPSC自組織，這仍然需要一個(gè)強(qiáng)大的成骨分化因素。剪切力已被廣泛研究用于干細(xì)胞/骨細(xì)胞的成骨分化。盡管剪切應(yīng)力對(duì)改善骨組織工程很有吸引力，但其對(duì)iPSCs成骨分化的影響尚不清楚。

因此，日本東北大學(xué)牙科研究生院、泰國(guó)朱拉隆功大學(xué)牙科學(xué)院等研究團(tuán)隊(duì)假設(shè)特定的剪切應(yīng)力可以增強(qiáng)小鼠iPSC成骨分化。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，使用剪切應(yīng)力加載裝置在成骨誘導(dǎo)下將剪切應(yīng)力施加到附著型胚狀體（EB）培養(yǎng)物上，使細(xì)胞承受連續(xù)的剪切力。

連續(xù)剪切應(yīng)力對(duì)小鼠iPSC活力、增殖和多能性的影響

小鼠牙齦來(lái)源的 iPSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，用三種不同程度的剪切應(yīng)力（0.15、0.5和1.5 Pa）應(yīng)用于粘附的iPSCs。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測(cè)試的幅度沒(méi)有明顯影響細(xì)胞活力。1天后，與生長(zhǎng)培養(yǎng)基（ES培養(yǎng)基）相比，細(xì)胞增殖顯著減少。將細(xì)胞在靜態(tài)條件下再維持兩天后，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)明顯低于ES培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)。第3天，在剪切應(yīng)力（0.15、0.5和1.5 Pa）下，細(xì)胞數(shù)顯著低于靜態(tài)組，且呈力依賴性下降。施加剪切應(yīng)力2 天后，Oct3/4、Sox2和Nanog的基因表達(dá)略有增加，而Klf4表達(dá)以力依賴性方式略有下降。剪切應(yīng)力加載組中Nanog和Oct4的蛋白表達(dá)增加。0.5和1.5 Pa剪切力加載組的Klf4蛋白表達(dá)量下降，而在0.15 Pa的剪切應(yīng)力加載下，Klf4表達(dá)量略有增加。

連續(xù)剪切應(yīng)力對(duì)小鼠iPSCs成骨分化的影響

實(shí)驗(yàn)探討了不同剪切力大小對(duì)成骨表達(dá)的影響。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，在剪切應(yīng)力作用下，osterix蛋白（Osx）、骨鈣素（Ocn）和骨橋蛋白（Opn）均顯著上調(diào)。OCN表達(dá)在0.5 Pa組中最高（圖1 A）。相對(duì)于靜態(tài)組，膠原蛋白1a1（Col1a1）表達(dá)僅在0.5 Pa組中顯著增加。與靜態(tài)組相比，Runx2的表達(dá)水平在0.15和1.5 Pa組中受到抑制，但在0.5 Pa組中未被抑制（圖1 A）。成骨相關(guān)蛋白Osx、Col1a1和Opn在剪切應(yīng)力應(yīng)用組中的表達(dá)高于靜態(tài)組（圖1 B）。在所有組的EB區(qū)均觀察到陽(yáng)性茜素紅S（ARS）染色（圖1 C）。相反，在剪切應(yīng)力加載組中觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域的陽(yáng)性染色（圖1 C）。ARS染色的定量顯示，相對(duì)于靜態(tài)組，礦化度顯著增加，在0.5 Pa組中觀察到最高的礦化度（圖1 D）。

圖1   連續(xù)剪切應(yīng)力以與力無(wú)關(guān)的方式增強(qiáng)了iPSCs的成骨分化

剪切應(yīng)力持續(xù)時(shí)間對(duì)小鼠iPSCs成骨分化的影響

在施加剪切應(yīng)力24 h后，Osx和Ocn上調(diào)（圖2 A）。暴露48小時(shí)后，Osx表達(dá)相對(duì)于靜態(tài)組的倍數(shù)變化進(jìn)一步增加。在剪切應(yīng)力12 h后，Col1a1和Opn顯著上調(diào)，后者在24 h和48 h分別進(jìn)一步增加到3倍和7倍，而Col1a1表達(dá)的倍數(shù)變化在所有時(shí)間點(diǎn)都保持在2–2.5倍（圖2 A）。靜態(tài)組在12和24小時(shí)未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性染色。相反，在0.5 Pa組的生長(zhǎng)細(xì)胞區(qū)域中觀察到陽(yáng)性ARS染色（圖2 B）。ARS定量顯示，48 h內(nèi)0.5 Pa組的礦物沉積量明顯高于靜態(tài)組（圖2 C）。在施加剪切應(yīng)力（0.5 Pa）48 h后，Osx的表達(dá)和核定位增強(qiáng)（圖2 D、E）。相對(duì)于靜態(tài)組，Opn蛋白在0.5 Pa組中的表達(dá)更高（圖2 F、G）。

圖2   連續(xù)剪切應(yīng)力以時(shí)間依賴性方式增強(qiáng)了iPSCs的成骨分化

評(píng)估0.5Pa下的成骨分化；在施加0.5 Pa剪切應(yīng)力12、24和48小時(shí)之前，iPSCs在OS培養(yǎng)基中維持1天，在同一時(shí)間點(diǎn)收集OS培養(yǎng)基中的對(duì)照靜態(tài)培養(yǎng)物進(jìn)行評(píng)估。

連接蛋白43（Cx43）和Trpm7參與剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的小鼠iPSCs成骨分化

研究表明，剪切應(yīng)力通過(guò)p38和Erk1/2通路調(diào)控細(xì)胞表面通道Trpm7和Cx43，增強(qiáng)了小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞和人PDLCs的成骨分化。施加剪切應(yīng)力2天后，與靜態(tài)組相比，0.15、0.5和1.5 Pa剪切應(yīng)力組中Tprm7、Cx43、磷酸化-Erk1/2和磷酸化-p38蛋白的表達(dá)增強(qiáng)（圖3 A）。此外，在0.5 Pa組中觀察到最高的Cx43表達(dá)（圖3 A）。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，0.5 Pa組中的Cx43和磷酸化-Erk1/2表達(dá)顯著更高（圖3 B）。在靜態(tài)組中觀察到細(xì)胞核周圍的Cx43表達(dá)，而在細(xì)胞膜周圍觀察到0.5 Pa組中的Cx43表達(dá)更高（圖3 C、E）。剪切應(yīng)力（0.5 Pa）增強(qiáng)了細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中Erk1/2的磷酸化（圖3 D、E）。靜態(tài)組中的Trpm7表達(dá)主要在細(xì)胞核周圍檢測(cè)到，而0.5 Pa組中在整個(gè)細(xì)胞中觀察到Trpm7通道表達(dá)（圖3 F）。

圖3   連續(xù)剪切應(yīng)力增強(qiáng)iPSCs成骨分化的機(jī)制。在承受剪切應(yīng)力48小時(shí)后分析iPSCs

Erk1/2信號(hào)通路參與剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的小鼠iPSCs成骨分化

細(xì)胞毒性測(cè)定顯示，用1μM和10μM SCH772984（一種Erk1/2磷酸化抑制劑）處理沒(méi)有顯著差異。較高的濃度（20、30、40 和 50 μM）導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著降低（圖4 A）。在靜態(tài)和0.5 Pa組中以及用1 μM和10 μM SCH772984處理組中觀察到細(xì)胞形態(tài)不均勻（圖4 B）。在靜態(tài)培養(yǎng)組中，用1μM SCH772984處理24小時(shí)不影響成骨標(biāo)志基因（Osx和Ocn）表達(dá)。然而，用10μM SCH772984處理后，只有Osx基因表達(dá)顯著降低。相反，在施加剪切應(yīng)力（0.5 Pa）24 h后，Osx、Ocn和Opn上調(diào)。此外，抑制劑處理組的上調(diào)受到顯著抑制（圖4 C）。在施加剪切應(yīng)力一天后，在ARS染色之前將細(xì)胞在靜態(tài)條件下再維持5天。在剪切應(yīng)力組的生長(zhǎng)單元區(qū)域觀察到增強(qiáng)的礦物沉積（圖4 D）。用10μM SCH772984處理可抑制剪切應(yīng)力施加過(guò)程中的礦物沉積。茜素紅S的定量分析顯示，與靜態(tài)組相比，剪切應(yīng)力應(yīng)用組的礦物沉積顯著增強(qiáng)（圖4 E）。抑制劑處理組和靜態(tài)處理組之間未觀察到顯著差異。

圖4     抑制Erk1/2活性抑制了剪切應(yīng)力增強(qiáng)的iPSCs的成骨分化

圖5   剪切應(yīng)力增強(qiáng)小鼠iPSCs成骨分化及相關(guān)機(jī)制示意圖

剪切應(yīng)力通過(guò)連接蛋白43（Cx43）和Erk1/2信號(hào)通路增強(qiáng)小鼠iPSCs的成骨分化。Erk1/2活性的抑制部分抑制了成骨基因的表達(dá)。Trpm7表達(dá)和下游磷酸化-p38在剪切應(yīng)力下上調(diào)，這意味著它們可能參與了剪切應(yīng)力增強(qiáng)iPSCs的成骨分化。

總之，該研究發(fā)現(xiàn)剪切應(yīng)力增強(qiáng)了小鼠iPSCs的成骨分化，部分是通過(guò)Cx43和下游Erk1 / 2信號(hào)通路。此外，0.5 Pa將是誘導(dǎo)小鼠iPSC向成骨細(xì)胞分化的最佳剪切力大小。

參考文獻(xiàn)：Limraksasin P, Nattasit P, Manokawinchoke J, Tiskratok W, Vinaikosol N, Okawa H, Limjeerajarus CN, Limjeerajarus N, Pavasant P, Osathanon T, Egusa H. Application of shear stress for enhanced osteogenic differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 2022 Nov 8;12(1):19021. doi: 10.1038/s41598-022-21479-8. PMID: 36347883.

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