長期以來，內(nèi)皮功能障礙和炎癥一直被認為是動脈粥樣硬化發(fā)病機制中的最早事件，因此是一個有價值的治療靶點。振蕩剪切應力（OSS）通過觸發(fā)信號分子的釋放來激活內(nèi)皮細胞中的炎癥反應，以響應流量感應受體的機械激活。暴露于高剪切應力和層流區(qū)域的內(nèi)皮細胞通過釋放無數(shù)動脈粥樣硬化保護基因（包括Kruppel樣因子2（KLF2））而具有動脈粥樣硬化保護能力。IL-8 和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的表達驅動單核細胞募集到血管系統(tǒng)中的 OSS 區(qū)域，其中粘附分子包括血管粘附分子（VCAM）-1 和內(nèi)皮細胞選擇素（E-selectin）導致單核細胞和白細胞滾動并粘附在內(nèi)皮上。

KLF2是一種重要的鋅指轉錄因子，對動脈粥樣硬化產(chǎn)生具有保護作用。在層流剪切應力誘導下，KLF2下調(diào)VCAM-1和E-選擇素的表達，從而減弱單核細胞與內(nèi)皮細胞的粘附。然而，KLF2在暴露于OSS的動脈分支和其他區(qū)域表達降低，這些區(qū)域長期以來一直被認為容易發(fā)生動脈粥樣硬化病變。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（ERK5）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成員，也密切參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮炎癥和動脈粥樣硬化的發(fā)生。

最近，G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）家族作為多種疾病的有價值的治療靶點受到重視。在GPCR家族的大約800個成員中，GPR81，也稱為羥基羧酸受體1（HCAR1），是一種選擇性乳酸敏感受體，已知在多種細胞類型中表達，包括腦細胞、脂肪細胞、各種癌細胞和視網(wǎng)膜等。GPR81已被證明在骨髓內(nèi)皮細胞中高表達，據(jù)報道，GPR81介導的乳酸信號通路可調(diào)節(jié)炎癥反應。

在華中阜外醫(yī)院（河南省人民醫(yī)院心臟中心）團隊的一項研究中，探索了GPR81介導的乳酸信號通路在OSS誘導的內(nèi)皮炎癥中的潛在作用。

首先，實驗進行了實時PCR和蛋白質印跡分析，以確定暴露于OSS對HUVECs中GPR81表達的影響。如圖1 所示，持續(xù)暴露至 5 dyn/cm2 OSS以時間依賴性方式顯著降低HUVECs中GPR81的表達。在 24 小時時間點下，GPR81 的表達在 mRNA 和蛋白質水平上均降低了 50% 以上。

圖1   暴露于振蕩剪切應力（OSS）抑制了人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）中的GPR81。HUVECs用OSS處理（5 dyn/cm2） 8、16 和 24 小時。

（a）實時熒光定量PCR顯示OSS在mRNA水平上降低了GPR81的表達。（b）蛋白質印跡顯示OSS在蛋白質水平上降低了GPR81的表達。

不同的流動模式在內(nèi)皮細胞中引發(fā)不同的生物反應。經(jīng)歷OSS的內(nèi)皮細胞進入促炎狀態(tài)，而暴露于生理高剪切力（HSS）的內(nèi)皮細胞則具有抗炎特性并表達動脈粥樣硬化保護分子。通過將HUVECs暴露于OSS或HSS（15 dyn/cm2）中24小時，實驗進一步研究了OSS和HSS對GPR81表達的調(diào)控是否不同。結果表明，HSS在mRNA和蛋白質水平上顯著增加了GPR81的表達，這與OSS的效果相反。這些數(shù)據(jù)表明，剪切應力具有直接增加或降低GPR81基礎表達水平的能力。

氧化應激是內(nèi)皮功能障礙過程中的關鍵因素。因此，研究了乳酸（GPR81特異性激動劑）對OSS誘導的氧化應激的影響。如圖2所示，暴露于OSS使線粒體活性氧（ROS）的產(chǎn)生增加到大約四倍。然而，用乳酸處理將ROS的產(chǎn)生降低到僅約1.5倍基線水平，因此表明乳酸具有有效的抗氧化特性。

圖2   用乳酸抑制振蕩剪切應力（OSS）誘導的線粒體ROS生成。HUVECs在存在或不存在7.5、15 mM乳酸24小時的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2）。線粒體ROS通過用MitoSOX紅染色來測量。

接下來，確定了乳酸介導的激活參與OSS誘導的幾種關鍵炎性細胞因子和趨化因子的表達。結果表明，OSS在mRNA和蛋白質水平上觸發(fā)了IL-6、IL-8和MCP-1表達的顯著增加。然而，乳酸的存在導致這些分子的表達顯著降低。同時，乳酸以劑量依賴性方式將OSS誘導的HMGB1表達從約5.2倍降低到僅1.8倍。

為了確定乳酸對OSS誘導的單核細胞與內(nèi)皮細胞粘附的影響，實驗研究了乳酸對VCAM-1和E-選擇素表達的影響。如圖3所示，實時熒光定量PCR和蛋白質印跡分析的結果表明，OSS分別在mRNA水平，特別是在蛋白質水平上顯著增加了VCAM-1和E-selectin的表達。同時，兩劑乳酸的加入極大地抑制了OSS誘導的這兩種粘附分子的表達。為了確認乳酸的這種潛在的抗單核細胞粘附能力，進行了實驗以確定暴露于OSS時附著在HUVECs上的人白血病細胞單核細胞U937的數(shù)量。結果表明，OSS將附著的U937細胞的數(shù)量增加到大約3.3倍，通過兩劑乳酸以劑量依賴性方式減少到僅2.1倍和1.5倍。

圖3   用乳酸抑制振蕩剪切應力（OSS）誘導的VCAM-1和E-選擇素表達。

HUVECs在存在或不存在7.5、15mM乳酸24小時的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2）。（a）通過實時PCR分析確定的VCAM-1和E-選擇素的mRNA水平。（b） 通過蛋白質印跡分析確定的 VCAM-1 和 E-選擇素的蛋白質水平。

最后，實驗研究了KLF2和ERK5通路在介導GPR81激活的這些保護作用中的參與。結果表明，暴露于OSS使動脈粥樣硬化保護性轉錄因子KLF2的表達降低了約65%，通過使用乳酸激活GPR81，KLF2在mRNA和蛋白質水平上以劑量依賴性的方式恢復到接近基線水平。

為了確定ERK5通路在GPR81介導的KLF2表達恢復中的參與，首先測量了暴露于OSS和兩劑乳酸時的磷酸化和總ERK5水平。如圖4 a所示，OSS顯著降低了p-ERK5的水平，而乳酸以劑量依賴性方式挽救了p-ERK5的水平。接下來，使用特異性ERK5抑制劑XMD8-92來確認GPR81對KLF2的拯救是通過ERK5介導的。如圖4 b、c所示，抑制ERK5在mRNA和蛋白質水平上消除了乳酸介導的對KLF2表達的恢復，從而表明乳酸介導的GPR81激活對OSS誘導的KLF2表達抑制的保護作用取決于ERK5通路。

圖4   乳酸誘導的KLF2表達由ERK5介導。

（a）HUVECs在存在或不存在7.5、15mM乳酸24小時的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2），測量p-ERK5和總ERK5。（b）HUVECs在存在或不存在15 mM乳酸24小時或特異性ERK5抑制劑XMD8-92（10 nM）的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2），測量KLF2的mRNA水平。（c） HUVECs在存在或不存在15 mM乳酸24小時或特異性ERK5抑制劑XMD8-92（10 nM）的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2），測量KLF2的蛋白質水平。

為了進一步證實GPR81參與介導乳酸對HUVECs中OSS誘導的內(nèi)皮功能障礙的保護作用，用siGPR81轉染細胞。GPR81的成功敲低如圖5 a。重要的是，發(fā)現(xiàn)敲低GPR81消除了乳酸對OSS誘導的VCAM-1和E-選擇素表達的抑制作用（圖5 b）。GPR81的沉默也阻止了乳酸對OSS誘導的U937細胞附著于HUVECs的抑制作用（圖5 c）。這些發(fā)現(xiàn)表明，乳酸對OSS誘導的HUVECs內(nèi)皮功能障礙的抑制作用是由GPR81介導的。

圖5   敲低GPR81消除了乳酸對內(nèi)皮功能障礙的抑制作用。

（a）蛋白質印跡分析顯示GPR81成功敲低。（b）通過蛋白質印跡分析測量VCAM-1和E-選擇素的表達。（c）測定U937細胞與HUVEC的附著。

總之，該研究結果證明了GPR81作為有效的動脈粥樣硬化保護受體的新作用。GPR81在暴露于OSS的血管動脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)域中的特異性激活可以通過抑制內(nèi)皮炎癥和氧化應激，抑制粘附分子的表達以及上調(diào)保護性KLF2轉錄因子的低表達來抑制動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化病變的發(fā)展。

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