動脈硬化被認(rèn)為是高血壓的并發(fā)癥和各種心血管疾病的合并癥。臨床上，動脈硬化可以通過測量臂踝脈搏波傳導(dǎo)速度（PWV）進(jìn)行非侵入性評估。功能失調(diào)的內(nèi)皮在血管僵硬的病理學(xué)中起主要作用。血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的可塑性，其特點是從收縮表型到增殖表型的去分化轉(zhuǎn)變，也有助于動脈硬化。然而，血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）和 VSMCs 之間的生理通訊是血管穩(wěn)態(tài)的組成部分。

MicroRNAs（miRNA）是小型的非編碼RNAs。越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞外 miRNAs 可以作為心血管疾病診斷、治療和預(yù)后的生物標(biāo)志物。心血管系統(tǒng)中 miR-92a 水平升高與心血管疾病的病理生理學(xué)有關(guān)。循環(huán) miR-92a 水平與高血壓的臨床標(biāo)志物如24小時動態(tài)血壓參數(shù)、頸動脈內(nèi)膜-中膜厚度和頸動脈-股動脈 PWV 相關(guān)，因此，miR-92a 在高血壓的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。

之前研究表明，增加的 miR-92a 水平通過靶向 Krüppel 樣因子2（KLF2）、KLF4 和 sirtuin 1（SIRT1）等基因?qū)е?EC 功能障礙，這些基因?qū)Ψ€(wěn)態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞至關(guān)重要。EC miR-92a 可通過細(xì)胞外囊泡（EVs）轉(zhuǎn)運至巨噬細(xì)胞，以下調(diào) KLF4 水平。然而，尚不清楚高血壓發(fā)作期間 ECs 中失調(diào)的 miR-92a 水平是否會導(dǎo)致動脈硬化，如果是，其潛在機(jī)制是否涉及通過 miR-92a 進(jìn)行 EC-VSMC 通訊。

因此，西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科、西北大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部、美國加州大學(xué)醫(yī)學(xué)院心臟病學(xué)系的一項聯(lián)合研究曾探索了 miR-92a 在 EC-VSMC 串?dāng)_中的作用及其對動脈硬化的相應(yīng)影響。結(jié)果揭示了人類和小鼠循環(huán)的 miR-92a 水平與 PWV 之間的負(fù)相關(guān)。潛在機(jī)制涉及 ECs 中增加的 miR-92a 水平，調(diào)節(jié) VSMC 可塑性。鎖定核酸-修飾的反義 miR-92a（LNA-miR-92a）改善了血管緊張素II（Ang II）誘導(dǎo)的小鼠高血壓，這表明 miR-92a 拮抗劑在改善動脈硬化方面具有治療潛力。

高血壓患者血清 miR-92a 水平升高

首先，實驗設(shè)置了高血壓患者組和健康對照組。從血液中分離血清并測量 miR-92a的水平。結(jié)果表明，與健康對照組相比，高血壓患者表現(xiàn)出顯著更高的循環(huán) miR-92a 水平（圖1 A）。

為了研究 miR-92a 的循環(huán)水平是否與動脈硬化相關(guān)，實驗比較了兩組的 PWV，一種評估動脈僵硬度的指標(biāo)。結(jié)果表明，高血壓患者的 PWV 高于對照組（圖1 B）。高血壓患者的血清 NO 水平顯著低于對照組（圖1 C），但血清內(nèi)皮素-1（ET-1）水平較高（圖1 D）。血清 miR-92a 水平與收縮壓和舒張壓（SBP 和 DBP）、臂踝 PWV（baPWV）和血清 ET-1 水平呈正相關(guān)（圖1 E-H），但與血清 NO 水平呈負(fù)相關(guān)（圖1 I）。此外，baPWV 與血清 NO 水平呈負(fù)相關(guān)，但與血清 ET-1 水平呈正相關(guān)（圖1 J、K）。這些結(jié)果表明，循環(huán)中的 miR-92a 水平提示高血壓發(fā)作期間的內(nèi)皮功能障礙和動脈硬化。

圖1   高血壓患者的血清 miR-92a 水平升高。

（A）對高血壓（HTN）和健康對照組（HC）患者血清miR-92a水平的qPCR分析。（B）患者和對照組的臂踝脈搏波速度（baPWV）。（C、D）血清 NO 和 ET-1 水平。（E-I）血清 miR-92a 水平與 baPWV（E）、SBP（F）、DBP（G）、血清 ET-1（H）和 NO（I）之間的相關(guān)性。（J、K）baPWV 與血清 NO（J）和 ET-1（K）水平的相關(guān)性。

Ang II 誘導(dǎo) miR-92a 和 EC 功能障礙

高血壓發(fā)作期間升高的 Ang II 水平對心血管系統(tǒng)具有不利作用。因此，實驗檢查了 ECs 中的 miR-92a 是否可以被 Ang II 誘導(dǎo)。Ang II 處理后以劑量和時間依賴性方式增加 ECs 中 miR-92a 的水平（圖2 A、B）。對 ECs 穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的基因，包括 eNOS、KLF2 和 KLF4，都是 miR-92a 的靶點。Ang II 處理降低了 ECs 中 eNOS、KLF2 和 KLF4 的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平（圖2 C、D），但促炎和纖維化 ET-1 的表達(dá)增加（圖2 C、D）。這些結(jié)果表明，Ang II 誘導(dǎo)的 EC 功能障礙可能是由升高的 miR-92a 水平介導(dǎo)的。

圖2   Ang II誘導(dǎo) miR-92a 和 EC 功能障礙。

（A）用不同濃度的Ang II 處理24 h的HUVECs中miR-92a水平的miRNA qPCR分析。（B）用Ang II（200 nM）處理不同時間HUVECs 中miR-92a的相對水平。（C、D）用Ang II（200 nM）或PBS（Ctrl）處理 HUVECs 24 h，分別用qPCR和蛋白質(zhì)印跡法測定KLF2、KLF4、eNOS和ET-1的蛋白質(zhì)水平。

miR-92a 調(diào)節(jié) VSMCs 的表型變化

因為 VSMCs 的收縮到合成表型變化會導(dǎo)致動脈硬化，因此實驗探討了 ECs 中增加的 miR-92a 水平是否會影響 VSMC 表型。

在與 VSMCs 共培養(yǎng)之前，HUVECs 用 Ang II 或 PBS 處理 24 小時（圖3 A）。在用 Ang II 處理的 ECs 和從 Ang II 處理的 ECs 的條件培養(yǎng)基中分離的 EVs 中，miR-92a 的水平升高（圖3 B、C）。此外，與磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）處理的 ECs 相比，與 Ang II 處理的 ECs 共培養(yǎng)的 VSMCs 中的 miR-92a 水平升高（圖3 D）。

然后測量了與收縮和增殖表型相關(guān)基因的 mRNA 水平。在與 Ang II 處理的 ECs 共培養(yǎng)的 VSMCs 中，收縮標(biāo)志物（α-SMA、smoothelin 和smoothelin）的 mRNA 水平降低，但增殖標(biāo)志物（纖連蛋白、骨橋蛋白和血小板反應(yīng)蛋白）的 mRNA 水平增加（圖3 E）。

鑒于 miR-92a 水平在頸動脈內(nèi)膜損傷后顯著增加，實驗分析了來自頸動脈的 RNA-seq 數(shù)據(jù)（GSE164050）。與上述結(jié)果一致，VSMCs 收縮表型的標(biāo)記基因下調(diào)，而增殖表型的標(biāo)記基因上調(diào)（圖3 F）。

接下來研究了由 Ang II 刺激的 EC 衍生的 EVs 是導(dǎo)致 VSMCs 收縮到合成表型變化的原因。在與 VSMCs 共培養(yǎng)的 EC 之前，將 HUVECs 與 Ang II 和 20 μM GW4869 孵育 24 小時以阻斷或不阻斷 EVs的形成。如圖3 G-I，GW4869 處理減輕了 VSMCs 的收縮到合成表型的變化。實驗用從 Ang II 處理的 ECs 的條件培養(yǎng)基中分離出來的 EVs 進(jìn)一步處理 na?ve VSMC（圖3 J）。在 EVs 孵育下，ECs 和 VSMCs 中 miR-92a 的水平增加（圖3 K、L）。此外，在與 EC 衍生的 EVs 孵育的 VSMCs 中，纖連蛋白、骨橋蛋白和血小板反應(yīng)蛋白的 mRNA 水平增加，但 α-SMA、 smoothelin 和calponin的 mRNA 的水平降低（圖3 M）。

總的來說，結(jié)果表明，Ang II 誘導(dǎo)的 ECs 中的 miR-92a 水平可以通過 EVs 轉(zhuǎn)移到相鄰的 VSMCs，這導(dǎo)致 VSMCs 的收縮到合成表型的變化。

圖3   miR-92a調(diào)節(jié)VSMCs的表型變化。

（A）在靜態(tài)共培養(yǎng)系統(tǒng)中，在與VSMCs共培養(yǎng)之前，用200 nM Ang II或PBS（Ctrl）處理HUVECs 24 h。（B-D）HUVECs（B）、EVs（C）和VSMCs（D）中 miR-92a水平的qPCR分析。（E）與 Ang II 或 PBS 處理的 HUVECs 共培養(yǎng)的 VSMCs 中收縮基因和增殖基因的相對表達(dá)。（F）熱圖顯示根據(jù)內(nèi)膜損傷（N1-4）和對照組（C1-4）頸動脈中的Z評分的差異表達(dá)基因的表達(dá)。（G–I）與200 nM Ang II孵育24小時后，將20μM GW4869與HUVECs共培養(yǎng)24小時。EVs（G）和HASMCs（H）中的相對 miR-92a水平。指示基因在HASMCs中三組的相對表達(dá)（I）。（J）用Ang II 或PBS處理的HUVECs的條件培養(yǎng)基的EV處理Na?ve VSMCs 24小時。（K、L）HUVECs和VSMCs中miR-92a mRNA水平的qPCR分析。（M）用Ang II或Ctrl組EC 衍生EVs 處理的VSMCs中指示基因的相對表達(dá)。

LNA-miR-92a 降低高血壓易感性

為了進(jìn)一步闡明 miR-92a 在該小鼠模型中 VSMCs 表型轉(zhuǎn)變中的作用，實驗評估了小鼠主動脈中與收縮與增殖表型相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本。與 LNA-Ctrl 給藥相比，LNA-miR-92a 給藥顯著降低了主動脈 ECs 和 SMCs 中 Ang II 升高的 miR-92a 水平。在接受 Ang II 和 LNA-miR-92a 的小鼠的主動脈中，α-SMA、smoothelin、calponin 的 mRNA 水平降低，而纖連蛋白、骨橋蛋白和血小板反應(yīng)蛋白的 mRNA 水平升高。因此，外源性施藥 LNA-miR-92a 可有效減輕與 Ang II 誘導(dǎo)的小鼠高血壓相關(guān)的動脈僵硬度。

為了證明 CD144⁺ -EVs 中的 miR-92a 對體內(nèi) VSMCs 的表型變化至關(guān)重要，實驗還從用 Ang II 或鹽水處理的小鼠中分離出血清 CD144⁺ -EVs，然后將這些 EVs 注射到野生型小鼠中。結(jié)果表明，從 Ang II 處理的小鼠分離的 CD144⁺ -EVs的小鼠的血清和 VSMC miR-92a 水平顯著增加。一致地，接受這些 CD144⁺ -EVs的小鼠的 VSMC 收縮標(biāo)志物顯著降低，而增殖標(biāo)志物增加。

這些數(shù)據(jù)表明，CD144⁺ -EVs 與 miR-92a 相關(guān)，至少在一定程度上有助于 Ang II 給藥小鼠的血管功能障礙和 VSMC 表型轉(zhuǎn)變。

圖4   EC miR-92a在Ang II刺激下調(diào)節(jié)VSMCs可塑性的示意圖。

Ang II誘導(dǎo)的EC功能障礙可導(dǎo)致EC-miR-92a通過EVs轉(zhuǎn)移到鄰近的VSMCs，以調(diào)節(jié)VSMCs的收縮至增殖表型變化，從而導(dǎo)致動脈硬化。

動脈硬化被認(rèn)為是高血壓的并發(fā)癥，由血壓升高的長期不良反應(yīng)以及其他危險因素引起。反過來，血管僵硬是高血壓的病理性罪魁禍?zhǔn)?。在分子水平上，動脈僵硬受到VSMC張力和EC信號傳導(dǎo)的影響，這些信號傳導(dǎo)是由衰老、血管生長因子、鈣化以及先天性和適應(yīng)性免疫的激活引起的。在這項研究中，發(fā)現(xiàn)功能失調(diào)的ECs和VSMCs之間的串?dāng)_可以促進(jìn)動脈硬化。具體而言，細(xì)胞外miR-92a豐度升高從受損的ECs運輸?shù)?/span>VSMCs，從而促進(jìn)血管僵硬。

參考文獻(xiàn)：Wang C, Wu H, Xing Y, Ye Y, He F, Yin Q, Li Y, Shang F, Shyy JY, Yuan ZY. Endothelial-derived extracellular microRNA-92a promotes arterial stiffness by regulating phenotype changes of vascular smooth muscle cells. Sci Rep. 2022 Jan 10;12(1):344. doi: 10.1038/s41598-021-04341-1. PMID: 35013491; PMCID: PMC8748448.

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