幾十年來，糖尿病及其臨床并發(fā)癥（如糖尿病腎病和冠狀動(dòng)脈疾病）的全球患病率和死亡率一直在上升。值得注意的是，內(nèi)皮功能障礙、氧化應(yīng)激和炎癥是糖尿病和心血管疾病發(fā)展中的相互關(guān)聯(lián)的因素?；钚匝酰≧OS）的增加會(huì)加重血管炎癥，反之亦然。增強(qiáng)的氧化和炎癥負(fù)荷會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。

miRNAs 是一類短的非編碼 RNAs（約 22 個(gè)核苷酸），負(fù)責(zé)不同細(xì)胞過程中的基因調(diào)控。在 miR-181 家族成員（miR-181a、miR-181b、miR-181c 和 miR-181d）中，發(fā)現(xiàn) miR-181b 與 2 型糖尿病患者血漿中的血管炎癥和血栓形成呈負(fù)相關(guān)。然而，miR-181b 是否在糖尿病進(jìn)展過程中在血管細(xì)胞中異常表達(dá)，以及 miR-181b 上調(diào)是否能改善糖尿病相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙仍不清楚。

AMP 活化蛋白激酶（AMPK）是真核生物中的關(guān)鍵參與者，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)能量代謝。此外，AMPK 激活被證明是內(nèi)皮細(xì)胞中 miRNA 生物發(fā)生的上游事件，其中 AMPK 可以磷酸化細(xì)胞核中的核仁素以調(diào)節(jié)miRNA 表達(dá)。研究 AMPK 激活是否通過靶向 miRNAs 來改善內(nèi)皮功能將是有意義的。

某些 miRNAs 被認(rèn)為是機(jī)械敏感的，因?yàn)樗鼈冊(cè)趦?nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)在暴露于不同的剪切模式時(shí)會(huì)發(fā)生改變。因此，剪切應(yīng)力介導(dǎo)的 miRNA 表達(dá)改變部分有助于內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。此外，暴露于剪切應(yīng)力可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中的 AMPK 激活。

在香港城市大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)系、香港中文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部中西醫(yī)結(jié)合學(xué)系等聯(lián)合團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)項(xiàng)研究中，探討了（i）研究糖尿病患者動(dòng)脈組織中 miR-181b 的水平；（ii）研究 miR-181b 上調(diào)是否對(duì)糖尿病相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙具有保護(hù)作用；（iii）確定 miR-181b 的潛在分子機(jī)制和上游誘導(dǎo)因子。

糖尿病患者中 miR-181b 表達(dá)降低

為了評(píng)估糖尿病條件下血管中 miR-181b 的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)首先測(cè)量并比較了非糖尿病患者和糖尿病患者腎動(dòng)脈中的 miR-181b 水平。結(jié)果表明，與非糖尿病患者相比，糖尿病患者腎動(dòng)脈中 miR-181b 的表達(dá)顯著降低（圖1 A）。接下來試圖確定哪種糖尿病風(fēng)險(xiǎn)因素會(huì)調(diào)節(jié) miR-181b 的表達(dá)。在糖尿病期間，AGEs 水平升高，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)或脂質(zhì)在暴露于糖時(shí)被糖化。AGEs 的積累會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和炎癥。因此，實(shí)驗(yàn)假設(shè) AGEs 下調(diào)動(dòng)脈和內(nèi)皮細(xì)胞中的 miR-181b。正如所料，AGEs（200 μg mL-1）的添加抑制非糖尿病患者腎動(dòng)脈中 miR-181b 的表達(dá)（圖1 B），以及在 HUVECs（圖1 C）。

圖1   miR-181b在人腎動(dòng)脈和內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。

（A）對(duì)非糖尿病和糖尿病患者腎動(dòng)脈中的  miR-181b 水平進(jìn)行 RT-PCR 檢測(cè)，（B）對(duì)接受 AGEs 200 μg mL-1 處理12小時(shí)的非糖尿病患者在腎動(dòng)脈中的 miR-181b 水平進(jìn)行 RT-PCR 檢測(cè)。（C）RT-PCR 檢測(cè)HUVECs 中用200 μg mL?1 AGEs處理12小時(shí)的miR-181b表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)接下來研究了 miR-181b 在糖尿病條件下血管系統(tǒng)中的作用，從正常食物喂養(yǎng)小鼠和糖尿病小鼠中解剖主動(dòng)脈，對(duì)ACh進(jìn)行功能測(cè)定，作為內(nèi)皮功能的指征，結(jié)果表明，miR-181b 過表達(dá)改善糖尿病小鼠主動(dòng)脈的內(nèi)皮功能。

然后研究了 miR-181b 過表達(dá)如何改善糖尿病小鼠血管系統(tǒng)的內(nèi)皮功能。由于 NO 和 ROS之間的不平衡會(huì)加重內(nèi)皮功能障礙，實(shí)驗(yàn)假設(shè) miR-181b 可能會(huì)抑制 ROS 過度產(chǎn)生以改善糖尿病狀態(tài)下的內(nèi)皮功能。因此，進(jìn)行了光澤精增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法和 DHE 染色，以確定糖尿病小鼠主動(dòng)脈中 ROS 的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)表明，miR-181b 過表達(dá)抑制糖尿病小鼠主動(dòng)脈血管 ROS，而且miR-181b 可能部分介導(dǎo) AMPK 在糖尿病條件下血管系統(tǒng)中的抗氧化作用。

實(shí)驗(yàn)還假設(shè) miR-181b 通過抑制血管炎癥來改善內(nèi)皮功能，因?yàn)槎喾N炎癥機(jī)制會(huì)觸發(fā)內(nèi)皮激活和功能障礙，從而加劇心血管疾病的進(jìn)展。因此，研究了糖尿病條件下小鼠主動(dòng)脈（即 Icam1、Vcam1 和 Il-6）和培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞（即 ICAM1、VCAM1 和 IL-6）中常見炎癥標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果表明，miR-181b 過表達(dá)抑制血管和內(nèi)皮炎癥，這些發(fā)現(xiàn)還暗示 AMPK 的激活可部分通過 miR-181b 在血管系統(tǒng)和內(nèi)皮細(xì)胞中引發(fā)抗炎作用。

AMPK 激活增加人動(dòng)脈和內(nèi)皮細(xì)胞中 miR-181b 的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明 miR-181b 抑制劑的存在消除了 AMPK 激活劑 AICAR 的血管松弛、抗氧化和抗炎作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的假設(shè)，即 AMPK 激活上調(diào) miR-181b 在動(dòng)脈和內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，用 AICAR 處理了人腎動(dòng)脈和 HUVECs。AICAR（2 mmol L-1）的存在上調(diào)了非糖尿病患者腎動(dòng)脈中 miR-181b 的水平（圖2 A），以及在 HUVECs中（圖2 B）。此外，AMPK 抑制劑 ara-A（1 mmol L-1）的存在逆轉(zhuǎn)了 HUVECs 中 AICAR 對(duì) miR-181b 的上調(diào)作用（圖2 C）。這些結(jié)果表明，內(nèi)皮細(xì)胞中存在 AMPK/miR-181b 軸。

圖2   AMPK活化對(duì)人動(dòng)脈和內(nèi)皮細(xì)胞miR-181b水平的影響。

（A）RT-PCR檢測(cè)miR-181b在AICAR治療的非糖尿病患者腎動(dòng)脈中的表達(dá)。（B）RT-PCR檢測(cè) AICAR 對(duì) HUVECs 中 miR-181b 表達(dá)的時(shí)間依賴性影響。（C） RT-PCR檢測(cè)1 mmol L?1 ara-A 處理 HUVECs 12 h后miR-181b水平。

長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)激活糖尿病小鼠的 AMPK/miR-181b 軸

實(shí)驗(yàn)接下來試圖確定在糖尿病條件下可以激活血管系統(tǒng)中 AMPK/miR-181b 軸的潛在方法。運(yùn)動(dòng)通常被認(rèn)為對(duì)糖尿病患者的心血管健康有益，而長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)先前已被證明可激活糖尿病小鼠動(dòng)脈中的 AMPK。因此，假設(shè)長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)可以通過 AMPK 激活增加動(dòng)脈中 miR-181b 的表達(dá)。因此，讓非糖尿病 db/m小鼠和糖尿病 db/db 小鼠在電動(dòng)跑步機(jī)上進(jìn)行運(yùn)動(dòng)（圖 3 A），使用另一種 2 型糖尿病小鼠模型來確認(rèn)運(yùn)動(dòng)時(shí) AMPK/miR-181b 軸的存在。與久坐組相比，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)在 db/m 和 db/db 小鼠的主動(dòng)脈中誘導(dǎo) AMPK 活化和 miR-181b 上調(diào)（圖3 B-D）。注射 AMPK 抑制劑化合物C（20 mg kg-1）可消除運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的 db/db 小鼠主動(dòng)脈中的 AMPK 活化和 miR-181b 上調(diào)（圖3 B-D）。這些發(fā)現(xiàn)表明，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)通過 AMPK 激活上調(diào) miR-181b。

圖3   長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病小鼠主動(dòng)脈 AMPK/miR-181b 軸的影響。

（A）糖尿病小鼠長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的示意圖概述。（B）具有代表性的蛋白質(zhì)印跡，以及（C）在久坐不動(dòng)或經(jīng)過運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的糖尿病小鼠的主動(dòng)脈中在Thr172處表達(dá)AMPK和p-AMPK的蛋白質(zhì)印跡的定量。（D）RT-PCR檢測(cè)在久坐不動(dòng)或運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的糖尿病小鼠的主動(dòng)脈中的miR-181b表達(dá)。

LSS 激活內(nèi)皮細(xì)胞中的 AMPK/miR-181b 軸

運(yùn)動(dòng)的好處是由身體中一系列生理、分子和細(xì)胞過程介導(dǎo)的。在運(yùn)動(dòng)過程中，全身血流量增加，導(dǎo)致血管系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生更高的剪切應(yīng)力。因此，推測(cè)增加的剪切應(yīng)力可能部分導(dǎo)致了運(yùn)動(dòng)期間內(nèi)皮細(xì)胞中 AMPK/miR-181b 軸的激活。為了驗(yàn)證，進(jìn)行了體外血流動(dòng)力學(xué)研究來模擬人內(nèi)皮細(xì)胞上增加的剪切應(yīng)力（即 LSS）（圖4 A）。暴露于 LSS（12 dyn/ cm2）12 小時(shí)可誘導(dǎo) HUVECs 中的 AMPK 活化和 miR-181b 上調(diào)（圖4 B-D）。同時(shí)，AMPK 抑制劑 ara-A（1 mmol L-1）的存在抑制了 HUVECs 中 AMPK 的激活和 miR-181b 的上調(diào)（圖4 B-D），暗示內(nèi)皮細(xì)胞中存在 LSS/AMPK/miR-181b 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)軸。

圖4   LSS對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中 AMPK/miR-181b 軸的影響。

（A）流動(dòng)系統(tǒng)示意圖。（B）AMPK and p-AMPK 具有代表性的蛋白質(zhì)印跡，以及（C）在暴露于LSS 12 h的HUVECs中在THr172位點(diǎn)下表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡的定量。（D）RT-PCR檢測(cè) miR-181b在LSS暴露 的HUVECs中的表達(dá)。

總之，該研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的動(dòng)脈中 miR-181b 水平降低。miR-181b 可減輕糖尿病小鼠的內(nèi)皮功能障礙、血管炎癥和氧化應(yīng)激。AMPK 激活上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中的 miR-181b 水平。此外，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)可能通過增加血流量來激活內(nèi)皮細(xì)胞中的 AMPK/miR-181b 軸。這些發(fā)現(xiàn)表明，AMPK/miR-181b 軸對(duì)糖尿病相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙具有有益作用。

參考文獻(xiàn)：Cheng CK, Shang W, Liu J, Cheang WS, Wang Y, Xiang L, Lau CW, Luo JY, Ng CF, Huang Y, Wang L. Activation of AMPK/miR-181b Axis Alleviates Endothelial Dysfunction and Vascular Inflammation in Diabetic Mice. Antioxidants (Basel). 2022 Jun 9;11(6):1137. doi: 10.3390/antiox11061137. PMID: 35740034; PMCID: PMC9220246.

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