成骨細胞是骨組織中高度分化的細胞，來源于間充質譜系。它們的主要功能是產生稱為類骨質的膠原物質，隨后被礦化形成成熟的骨骼。已知成骨細胞在其自身譜系（即骨祖細胞、骨襯細胞和骨細胞）內的不同分化階段與其他細胞交流。然而，最近的研究表明，成骨細胞也與其他骨骼細胞類型交流，特別是關節(jié)軟骨中的關節(jié)軟骨細胞。

近年來，骨-軟骨串擾的概念引起了人們的極大關注，特別是在關節(jié)損傷和疾病方面。對骨組織的直接機械損傷似乎可能通過骨-軟骨串擾間接影響軟骨組織。

骨細胞感知其物理機械環(huán)境變化的主要方式之一是通過沿其基質表面以及細胞外基質（ECM）的腔隙-小管系統(tǒng)（LCS）內的流體運動。這允許產生間質流體流動剪切應力（FFSS），其大小可以根據局部微觀解剖結構的變化而變化。機械刺激對骨骼和軟骨細胞的影響，以及它們之間產生的串擾，是理解創(chuàng)傷性骨關節(jié)炎（PTOA）等疾病的重要因素。然而，這種雙組織系統(tǒng)在受控的實驗室環(huán)境中研究也更加復雜，因此新的方法和模型系統(tǒng)對于實現這些目標非常重要。

愛爾蘭huangjia外科醫(yī)學院（RCSI）醫(yī)學和健康科學大學、都柏林大學圣三一學院、愛爾蘭科學基金會（SFI）先進材料與生物工程研究中心實驗團隊曾作過一項研究，主要目的是開發(fā)和表征體外骨-軟骨串擾系統(tǒng)及其對FFSS的反應能力。具體而言，他們評估了振蕩流體流動通過暴露于預定水平的FFSS對小鼠成骨細胞和軟骨細胞的影響，還研究了受刺激成骨細胞條件培養(yǎng)基對軟骨細胞的影響。其次要目的是在這項工作中評估細胞系和原代細胞之間的差異，比較了永生化成骨細胞和軟骨細胞系（分別為MC3T3-E1和ATDC5）在不同FFSS水平作用下對其原代對應物的反應。最后，證明了來自機械刺激受損的原代成骨細胞的條件培養(yǎng)基中的可溶性信號可以改變原代關節(jié)軟骨細胞的表型。

流體流動剪切應力（FFSS）對原代和細胞系成骨細胞增殖和分化的影響

將0.5-3.5 Pa范圍內的振蕩FFSS應用于細胞系和原代成骨細胞群（分別為MC3T3和MSC-OB）。兩種細胞類型在FFSS刺激至1 Pa 時，ALP和鈣的水平顯著上升（圖1 A、B）。然而，在大于1 Pa時，ALP和鈣水平均逐漸下降。此外，在大多數情況下，與MC3T3s相比，MSC-OB組中的ALP和鈣水平顯著更高，表明原代細胞對這種刺激的反應比它們的細胞系對應物更強烈。

圖1    不同水平的FFSS對MSC-OBs和MC3T3s在ALP，鈣和成骨基因表達方面的影響。（A）兩種細胞類型的ALP水平在預定的FFSS水平下，歸一化為DNA含量。（B）兩種細胞類型中的鈣水平在預定的FFSS水平下，歸一化為DNA含量。（C） 通過RT-PCR測定MSC-OB細胞中 Collagen、ALP、OCN、OPN、RUNX2 mRNA的基因表達水平。

圖1 A、B在ALP和鈣水平方面表現出非常一致的趨勢。此外，這兩個因素在原代細胞中的峰值水平均為1 Pa，這正是它們原位暴露的FFSS的大小。同樣，基因表達數據顯示，對于所檢查的所有成骨因子（OPN除外），峰值水平也為1 Pa。在大多數情況下，與細胞系對應物相比，原代細胞的反應幅度更大。此外，除了OPN在這個水平上略有增加，大多數被測量的基因在較高水平的FFSS（3-3.5 Pa）下顯示出顯著降低的表達。

接下來，進一步研究以確定和優(yōu)化振蕩流參數的頻率和持續(xù)時間對原代細胞的刺激（1 Pa）和損傷（3 Pa）機制的影響（圖2）。刺激狀態(tài)下使用的FFSS產生合成代謝反應，而破壞狀態(tài)下產生更多的分解代謝反應，去分化和肥大標記物增加。隨著頻率和持續(xù)時間的變化，在檢查的每個頻率（1和2 Hz）和每個時間點（1、2和4小時）上，1和3 Pa之間存在顯著差異。研究還發(fā)現，在大多數時間點，特別是在較長的持續(xù)時間下，2 Hz時的表達水平比1 Hz時有所下降。此外，每種細胞類型的鈣含量和Col I、RUNX2和OPN水平隨著時間的推移相對穩(wěn)定。

圖2   FFSS條件下的頻率和持續(xù)時間對1和3 Pa的MSC-OBs在ALP，鈣和成骨基因表達方面的影響。

（A）已歸一化為DNA含量的ALP水平。（B）鈣水平歸一化為DNA含量。（C） 通過 RT-PCR 檢測 MSC-Obs 中 Collagen I、ALP、OCN、OPN和 RUNX2 mRNA 的基因表達水平。

FFSS對軟骨細胞增殖和分化的影響

與無流動對照相比，原代關節(jié)軟骨細胞（ACs）對FFSS的反應也有明顯變化（圖3）。細胞以與先前實驗類似的方式暴露于FFSS（0-3.5 Pa）。最初，AC和ATDC5細胞之間的sGAG含量沒有顯著差異。然而，1 Pa似乎代表了一個閾值水平，該參數在原代軟骨細胞中達到峰值。在所有較高的FFSS量級上，sGAG（人硫酸鹽粘多糖）水平逐漸降低?；虮磉_數據顯示，Col II，AGG和Sox9表達水平也在1 Pa時達到峰值，但在不同細胞類型之間存在明顯差異。相比之下，Col I 和 Col X 分別在 2/3 Pa 時達到峰值。在所有情況下，與細胞系對應物相比，原代軟骨細胞表現出更強烈的反應。

圖3   不同水平的FFSS對原代ACs和ATDC5細胞的影響。

（A）兩種細胞類型的sGAG水平歸一化為DNA含量。（B） 通過 RT-PCR 檢測 I 型、II 型和 X 型膠原、SOX9 和蛋白聚糖 mRNA 的基因表達水平。

基于圖3的數據，然后使用刺激性（1 Pa）和破壞性（2 Pa）模型來確定原發(fā)性ACs如何對頻率和持續(xù)時間的變化做出反應（圖4）。實驗發(fā)現，在每個應力水平下，增加頻率和持續(xù)時間往往會降低sGAG含量和Col II、AGG和SOX9表達，相比之下，在相同條件下會增加肥厚標記Col X和Col I的表達。

圖4   FFSS條件在1和2 Pa下對原代ACs的頻率和持續(xù)時間對sGAG和基因表達的影響。（A） AC sGAG水平與DNA含量歸一化。（B） 通過 RT-PCR 檢測 ACs  I 型、II 型和 X 型膠原蛋白和 SOX9 的基因表達水平。

FFSS誘導的成骨細胞衍生的可溶因子對軟骨細胞的影響

最后，通過使用條件培養(yǎng)基實驗來確定FFSS誘導的成骨細胞衍生的可溶因子對軟骨細胞表型的影響。圖5表明，在刺激性 FFSS 水平（即 1 Pa）下，可溶性成骨細胞衍生因子導致軟骨細胞中 sGAG 的產生與對照水平相比增加。然而，在2、3和3.5 Pa處響應FFSS產生的可溶性因子導致sGAG含量較對照和峰水平降低，并且在基因水平上蛋白聚糖也發(fā)現了這種效應。令人驚訝的是，Col II基因在1 Pa時表達量的增加在該系統(tǒng)中并不明顯，并且對照組在2、3和3.5 Pa時的表達量與之前一樣。同樣，與高FFSS水平的對照組相比，SOX9的表達也減少了。Col I在2 Pa時表達量無顯著增加，而在3和3.5 Pa時表達量較1 Pa時減少。在Col X的情況下，表達譜與Col I有些相似，峰值為1 Pa，隨后在3和3.5 Pa處顯著降低。

這些數據表明，暴露于受刺激的成骨細胞衍生因子可能對AC表型產生顯著的幅度依賴性影響。

圖5   FFSS 誘導的可溶性成骨細胞衍生因子引起的軟骨細胞表型變化。

（A）暴露于FFSS誘導的可溶性成骨細胞衍生因子后，ACs中的sGAG水平歸一化為DNA含量。（B） 在暴露于條件培養(yǎng)基后 3 天后ACs 膠原 I、II 和 X 膠原蛋白、SOX9 和蛋白聚糖的基因表達。

總之，該研究開發(fā)了一種基于原代細胞的新型系統(tǒng)，可用于概括關節(jié)損傷后的成骨細胞損傷應激，以及隨后可能通過骨-軟骨串擾對軟骨細胞產生的有害影響。將來，參與該過程的具體途徑可用于確定在軟骨細胞中產生分解代謝影響的骨源性因子。這些信息還可以為PTOA和其他相關疾病的新型骨靶向生物學治療提供信息。

參考文獻：Hinton PV, Genoud KJ, Early JO, O'Brien FJ, Kennedy OD. Impact of Fluid Flow Shear Stress on Osteoblast Differentiation and Cross-Talk with Articular Chondrocytes. Int J Mol Sci. 2022 Aug 22;23(16):9505. doi: 10.3390/ijms23169505. PMID: 36012760; PMCID: PMC9408926.

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