蛋白尿是糖尿病腎?。?span style="font-family: 宋體, SimSun;">DKD）發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可直接導(dǎo)致腎損傷。多項(xiàng)研究表明減少蛋白尿可延緩終末期腎病的發(fā)展，然而，這些方法仍然不能令人滿意。

重吸收尿白蛋白的腎小管上皮細(xì)胞可以釋放趨化因子誘導(dǎo)免疫細(xì)胞，導(dǎo)致腎損傷。巨噬細(xì)胞是腎組織中最重要的免疫細(xì)胞類型，可誘導(dǎo)腎纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，腎巨噬細(xì)胞表達(dá)纖維化基因，可導(dǎo)致腎纖維化。由于巨噬細(xì)胞在疾病進(jìn)展過程中起著復(fù)雜的作用，因此需要進(jìn)一步探索其在DKD中的作用機(jī)制。

研究表明，損傷刺激下巨噬細(xì)胞的代謝變化與腫瘤細(xì)胞中的相似。刺激后，巨噬細(xì)胞引起糖酵解途徑的大量激活，其特征在于葡萄糖消耗增加，乳酸合成和糖酵解。最近的研究表明，巨噬細(xì)胞的兩種表型都表現(xiàn)出糖酵解活化增加。

腎小管上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的串?dāng)_是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能的關(guān)鍵。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，細(xì)胞外囊泡（EV）介導(dǎo)信息從腎小管上皮細(xì)胞到巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。之前發(fā)現(xiàn)白蛋白可以通過EVs促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化。因此，腎小管上皮細(xì)胞衍生的EVs也可能影響巨噬細(xì)胞代謝狀態(tài)。

目前，DKD期間腎巨噬細(xì)胞的代謝狀態(tài)尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)高血糖可以上調(diào)骨髓來源的巨噬細(xì)胞糖酵解。然而，被腎小管上皮細(xì)胞重吸收的白蛋白是否可以通過EVs影響巨噬細(xì)胞的代謝狀態(tài)尚不清楚。南方醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科、深圳市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科、中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院內(nèi)分泌科的聯(lián)合課題組研究了人血清白蛋白（HSA）對DKD期間腎巨噬細(xì)胞代謝狀態(tài)的影響及其潛在機(jī)制。

糖尿病腎巨噬細(xì)胞中糖酵解增加

為了探索DKD期間腎巨噬細(xì)胞的代謝狀態(tài)，使用2型糖尿病模型db/db小鼠，與非糖尿病db/m小鼠相比，通過qRT-PCR（圖1 A）和免疫組化染色（圖1 B）顯示，db/db小鼠纖維化（FN，α-SMA和Col-I）和炎癥（IL-6）標(biāo)志物的表達(dá)增強(qiáng)。

為了探索DKD期間腎巨噬細(xì)胞的代謝狀態(tài)和功能，分離了小鼠腎巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)db/db小鼠中的GLUT1，HK2和LDHA mRNA表達(dá)顯著增加，與db/m小鼠相比（圖1 C）。免疫熒光表明，db/db小鼠腎臟F4/80巨噬細(xì)胞中的GLUT1水平要高得多（圖1 D）。此外，發(fā)現(xiàn) db/db小鼠的腎巨噬細(xì)胞中IL1β和TGF-β1 mRNA水平升高（圖1 C）。這些事實(shí)表明，DKD小鼠腎巨噬細(xì)胞中糖酵解增強(qiáng)。

圖1   糖尿病腎巨噬細(xì)胞中糖酵解增加。

HSA處理的腎小管上皮細(xì)胞促進(jìn)巨噬細(xì)胞糖酵解

蛋白尿是DKD進(jìn)展的關(guān)鍵，過量的白蛋白通過腎小管上皮細(xì)胞影響巨噬細(xì)胞。為了進(jìn)一步探索白蛋白處理的腎小管上皮細(xì)胞是否也會(huì)影響巨噬細(xì)胞代謝狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)測量了糖酵解酶的表達(dá)。巨噬細(xì)胞與HSA處理的腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）共培養(yǎng)大大增強(qiáng)了mRNA水平的GLUT1，HK2和LDHA表達(dá)。在巨噬細(xì)胞中，HK2和LDHA的蛋白質(zhì)表達(dá)變化與其mRNA表達(dá)的變化平行。此外還發(fā)現(xiàn)，在與HSA處理的HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)后，巨噬細(xì)胞上清液中的乳酸水平顯著升高。

在之前的研究中，發(fā)現(xiàn)HSA處理的腎小管上皮細(xì)胞通過EVs影響巨噬細(xì)胞表型。接下來進(jìn)一步探索EVs在巨噬細(xì)胞糖酵解中是否是需要的，實(shí)驗(yàn)抑制了HK-2細(xì)胞衍生的EVs分泌，然后將這些細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)表明，HSA刺激的腎小管上皮細(xì)胞通過EVs影響巨噬細(xì)胞的糖酵解。

HSA處理的腎小管上皮細(xì)胞衍生的EVs促進(jìn)巨噬細(xì)胞糖酵解

研究進(jìn)一步證實(shí)，腎小管上皮細(xì)胞衍生的EVs會(huì)影響巨噬細(xì)胞代謝狀態(tài)。因此，分離了這些EVs，并通過透射電子顯微鏡（圖2 A）和納米顆粒跟蹤分析（圖2 B）表征了它們的形態(tài)和性質(zhì)。為了探索EVs是否可以被巨噬細(xì)胞內(nèi)化，將Dil-C18標(biāo)記的EVs與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24 h 后，EVs（紅色熒光）與巨噬細(xì)胞共定位（圖2 C）。然后，將巨噬細(xì)胞和HSA處理的HK-2細(xì)胞衍生的EVs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞中的糖酵解酶增加（圖2 D-F）。與HSA處理的HK-2細(xì)胞衍生的EVs共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞上清液乳酸水平（圖2 G） 和 IL1β 和 TGF-β1 的mRNA 水平（圖2 D）也更高。為了進(jìn)一步證實(shí)EVs通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞糖酵解來影響巨噬細(xì)胞功能，用糖酵解抑制劑2-DG處理巨噬細(xì)胞，以便與HSA處理的HK-2細(xì)胞衍生的EVs共培養(yǎng)。如圖2 H，2-DG 逆轉(zhuǎn)了 IL1β 和 TGF-β1 表達(dá)的上調(diào)。

為了證實(shí)HSA處理的HK-2細(xì)胞衍生的EVs在體內(nèi)影響巨噬細(xì)胞糖酵解，通過尾靜脈將EVs注射到小鼠體內(nèi)。結(jié)果表明，大多數(shù)EVs在注射后24 h 出現(xiàn)在肝臟和腎臟中。此外，注射了經(jīng)HSA處理的HK-2細(xì)胞衍生的EVs的db/db小鼠顯示出ACR水平升高（圖3 A）以及腎皮質(zhì)中纖維化和炎癥標(biāo)志物的表達(dá)（圖3 B、C）和腎巨噬細(xì)胞中糖酵解的增加（圖3 D、E）。這些結(jié)果表明，腎小管上皮細(xì)胞衍生的EVs可以在體外和體內(nèi)影響巨噬細(xì)胞糖酵解。

圖2   HSA處理的腎小管上皮細(xì)胞衍生的EVs在體外促進(jìn)巨噬細(xì)胞糖酵解。

圖3   HSA處理的腎小管上皮細(xì)胞衍生的EVs促進(jìn)了體內(nèi)巨噬細(xì)胞糖酵解。

HIF-1α促進(jìn)巨噬細(xì)胞糖酵解

根據(jù)一些報(bào)道，HIF-1α在促進(jìn)糖酵解中起重要作用。因此，為了研究HIF-1α在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞代謝重編程中是否是需要的，實(shí)驗(yàn)用HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞或用FG-4592（一種脯氨酰羥化酶抑制劑）處理巨噬細(xì)胞，分別下調(diào)或過表達(dá)HIF-1α。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIF-1α SIRNA顯著下調(diào)巨噬細(xì)胞GLUT1、HK2和LDHA（圖4 A） 和 HK2、LDHA 蛋白（圖4 B、C）表達(dá)。上清液中的乳酸鹽含量（圖4 D）和 IL1β 和 TGF-β1 的mRNA（圖4 A）在HIF-1α siRNA組中也有所下降。另一方面，FG-4592上調(diào)了GLUT1，HK2和LDHA mRNA（圖4 E）和 HK2 和 LDHA 蛋白（圖4 F、G）表達(dá)。乳酸含量（圖4 H）和IL1β和TGF-β1的水平在FG-4592組中也較高（圖4 E）。這些數(shù)據(jù)表明，HIF-1α促進(jìn)巨噬細(xì)胞糖酵解。

圖4   HIF-1α促進(jìn)巨噬細(xì)胞糖酵解。

HSA處理的腎小管上皮細(xì)胞衍生的EVs通過穩(wěn)定HIF-1α促進(jìn)巨噬細(xì)胞糖酵解

為了進(jìn)一步證實(shí)HF-1α在HSA處理的腎小管上皮細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞糖酵解中的作用，使用免疫熒光測量腎巨噬細(xì)胞中的HIF-1α水平。結(jié)果表明，db /db小鼠的腎巨噬細(xì)胞HIF-1α水平明顯高于對照小鼠。此外還發(fā)現(xiàn)，在與HSA處理的HK-2細(xì)胞衍生的EVs共培養(yǎng)的細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞HIF-1α表達(dá)增加，HIF-1α羥基化程度降低，表明HK-2細(xì)胞衍生的EVs提高了HIF-1α的穩(wěn)定性。而且HIF-1α在注射HSA處理的HK-2細(xì)胞衍生的EVs的db / db小鼠的腎巨噬細(xì)胞中表達(dá)增加。

為了進(jìn)一步證實(shí)HIF-1α參與糖酵解調(diào)節(jié)，用HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，與HSA刺激的HK-2細(xì)胞的EVs共培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIF-1α的敲低逆轉(zhuǎn)了GLUT1，HK2和LDHA水平、乳酸產(chǎn)量以及IL1β和TGF-β1表達(dá)的增加。這些結(jié)果表明，來自HSA刺激的HK-2細(xì)胞的EVs通過HIF-1α促進(jìn)巨噬細(xì)胞糖酵解。

最后，實(shí)驗(yàn)探索了HSA處理的HK-2細(xì)胞衍生的EVs如何調(diào)節(jié)HIF-1α的穩(wěn)定性，并發(fā)現(xiàn)EVs中有幾種被報(bào)道參與HIF-1α穩(wěn)定性的miRNAs和lncRNAs增加。

總之，該研究發(fā)現(xiàn)，DM小鼠的腎巨噬細(xì)胞中糖酵解增強(qiáng)。此外，HSA通過穩(wěn)定HIF-1α，通過腎小管上皮細(xì)胞衍生的EVs促進(jìn)巨噬細(xì)胞糖酵解，從而誘導(dǎo)腎纖維化和炎癥。由于白蛋白尿是DKD治療的障礙，這項(xiàng)研究表明，抑制腎巨噬細(xì)胞糖酵解可能是延緩DKD進(jìn)展的新方法。

參考文獻(xiàn)：Jia Y, Chen J, Zheng Z, Tao Y, Zhang S, Zou M, Yang Y, Xue M, Hu F, Li Y, Zhang Q, Xue Y, Zheng Z. Tubular epithelial cell-derived extracellular vesicles induce macrophage glycolysis by stabilizing HIF-1α in diabetic kidney disease. Mol Med. 2022 Aug 12;28(1):95. doi: 10.1186/s10020-022-00525-1. PMID: 35962319; PMCID: PMC9373297.

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