成纖維細胞是間充質(zhì)基質(zhì)中常見的貼壁細胞類型。成纖維細胞和間充質(zhì)干細胞具有相似的 MSC 標記，可以分化成成骨、脂肪和軟骨細胞譜系。成纖維細胞和間充質(zhì)干細胞的相似性支持使用成纖維細胞作為研究成骨的合適細胞類型。當干細胞處于由生物材料、生長因子和組織組成的微環(huán)境中時，適當?shù)臋C械刺激可以促進干細胞的成骨分化。臨床和基礎研究表明，外部機械刺激，例如因拉伸而增加的張力，可以影響干細胞的成骨分化。機械轉(zhuǎn)導通常通過整合素將機械刺激轉(zhuǎn)化為生化信號，然后影響下游細胞活動的過程。

整合素是存在于細胞表面的跨膜受體，是由非共價鍵連接的α和β亞基組成的功能性異二聚體。整合素的聚集和激活募集和激活細胞內(nèi)信號蛋白，如粘著斑激酶（FAK）、紐蛋白和踝蛋白，它們有助于粘著斑并影響干細胞的分化。

Yes 相關蛋白（YAP）是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，通過與可控制轉(zhuǎn)錄的 TEAD（TEA 結(jié)構(gòu)域 DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子家族）DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合，促進細胞增殖并調(diào)節(jié)干細胞分化。研究表明，通過敲除肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)因子或用 F-肌動蛋白抑制藥物處理來控制 F-肌動蛋白水平會顯著影響 YAP 活性。然而，機械刺激如何通過整合素-微絲軸影響 YAP 以調(diào)節(jié)干細胞成骨分化仍不清楚。

廣東省醫(yī)學生物力學重點實驗室、廣州醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院眼科的課題組曾研究了整合素αVβ3與循環(huán)拉伸應力（CTS）誘導的早期成骨分化之間的關系。整合素αVβ3的激活導致肌動蛋白絲重排并調(diào)節(jié)核YAP的表達。此外還發(fā)現(xiàn)FAK參與了粘著斑的形成，整合素αVβ3介導的FAK磷酸化在CTS誘導的成骨分化早期發(fā)揮了作用。該研究表明整合素αVβ3可作為骨修復的治療靶點。

循環(huán)拉伸應力促進成纖維細胞中的細胞增殖和成骨

研究探討了循環(huán)拉伸應力（0.5 Hz，10%）、細胞增殖和成纖維細胞成骨分化之間的關系。首先，成纖維細胞暴露于循環(huán)拉伸應力 4 天和 7 天。如圖1 a，成纖維細胞增殖響應于循環(huán)拉伸應力而增加。作為成骨分化標志物的 ALP 和 RUNX2 的蛋白質(zhì)和 RNA 表達在循環(huán)拉伸應力下 7 天后增加（圖1 c、d）。成纖維細胞的 ALP 染色也獲得了類似的結(jié)果，在循環(huán)拉伸應力下ALP 染色更高（圖1 b）。這些結(jié)果表明，循環(huán)拉伸應力促進了成纖維細胞的細胞增殖和早期成骨分化。

圖1   CTS下成纖維細胞中細胞增殖、早期成骨分化和整合素αVβ3的表達。

（a）細胞增殖在 CTS 下 1 天、4 天、7 天。（b ）ALP 染色在CTS 下 4 天和 7 天。（c）ALP和RUNX2蛋白表達在CTS下4天和7天。（d ）ALP和RUNX2 mRNA表達在CTS下4天和7天。（e）整合素αVβ3 mRNA表達在CTS下4天和7天。（f）整合素 αVβ3 的免疫熒光在 CTS 下 7 天。

循環(huán)拉伸應力誘導的早期成骨分化依賴于整合素αVβ3的表達和激活

為了探索整合素是否參與循環(huán)拉伸應力誘導的成骨分化和細胞增殖，通過qRT-PCR和免疫熒光分析了整合素αVβ3在成纖維細胞中的表達。實驗發(fā)現(xiàn)整合素αVβ3的表達在循環(huán)拉伸應力下增加（圖1 e、f），表明循環(huán)拉伸應力促進整合素αVβ3的表達。因此，研究了循環(huán)拉伸應力下整合素αVβ3與成骨分化之間的關聯(lián)。為了確定循環(huán)拉伸應力是否以整合素αVβ3依賴性方式刺激成骨分化，整合素αVβ3的功能被整合素αVβ3的拮抗劑shRNA或RGDyk抑制。如圖2 a，當成纖維細胞中整合素αV或β3的表達下調(diào)時，循環(huán)拉伸應力下細胞增殖減少。

然后，通過 ALP 染色、蛋白質(zhì)印跡和 qRT-PCR 檢測整合素 αVβ3 對成骨分化的影響。shRNA-整合素αV和β3組的ALP染色比CTS組少（圖2 b）。蛋白質(zhì)印跡顯示，在成纖維細胞中整合素αVβ3表達下調(diào)后，ALP和RUNX2的蛋白質(zhì)表達降低（圖2 c、e）。通過 qRT-PCR 獲得了類似的結(jié)果，當整合素 αVβ3 表達被抑制時，ALP 和 RUNX2 mRNA 的表達降低（圖2 d、f）。這些結(jié)果表明，循環(huán)拉伸應力通過整合素αVβ3促進成纖維細胞的早期成骨分化和細胞增殖。

圖2   CTS 通過整合素 αVβ3 調(diào)節(jié)細胞增殖和早期成纖維細胞成骨分化。

（a）GM、NC、shRNA-整合素αV和shRNA-整合素β3組在CTS下的細胞增殖。（b）GM、NC、shRNA-整合素αV和shRNA-整合素β3組在CTS下的ALP染色。（c）在 GM 和 RGDyk 組中 CTS 下 ALP 和 RUNX2 的蛋白質(zhì)表達。（d）GM 和 RGDyk 組在 CTS 下 ALP 和 RUNX2 的 mRNA 表達。（e）在 CTS 下GM、NC、shRNA-整合素 αV 和 shRNA-整合素 β3 組中 ALP 和 RUNX2 的蛋白質(zhì)表達。（f） CTS 下 GM、NC、shRNA-整合素 αV 和 shRNA-整合素 β3 組中 ALP 和 RUNX2 的 mRNA 表達

成骨過程中通過整合素αVβ3調(diào)節(jié)循環(huán)拉伸應力的肌動蛋白絲

為了更好地了解循環(huán)拉伸應力下整合素αVβ3與肌動蛋白絲之間的關聯(lián)，實驗檢測了整合素αVβ3被抑制時β-肌動蛋白的表達。蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR顯示β-肌動蛋白的表達在循環(huán)拉伸應力下增加。當整合素 αVβ3 的表達受到抑制時，RGDyk 組中 β-肌動蛋白的表達低于 CTS 組。還發(fā)現(xiàn) shRNA-整合素 αV 或 β3 組中 β-肌動蛋白的表達低于 CTS 組。免疫熒光顯示，微絲應力纖維在循環(huán)拉應力作用下呈網(wǎng)狀分散在靠近細胞膜的結(jié)構(gòu)中。當整合素αVβ3的表達受到抑制時，微絲應力纖維以與GM（培養(yǎng)基）組相似的拉長方式排列。這些結(jié)果表明，循環(huán)拉伸應力上調(diào)β-肌動蛋白的表達并通過整合素αVβ3改變肌動蛋白絲的結(jié)構(gòu)。

為了研究肌動蛋白絲是否參與由循環(huán)拉伸應力誘導的成骨分化，使用細胞松弛素D 來抑制肌動蛋白絲的聚合。蛋白質(zhì)印跡顯示，在循環(huán)拉伸應力下，細胞松弛素D降低了ALP和RUNX2的表達。這些結(jié)果表明，循環(huán)拉伸應力通過整合素αVβ3-微絲軸調(diào)節(jié)成纖維細胞成骨分化的早期階段。

成骨過程中通過整合素αVβ3-微絲軸調(diào)節(jié)循環(huán)拉伸應力核YAP

實驗還探討了循環(huán)拉伸應力是否通過整合素αVβ3-微絲軸調(diào)節(jié)核 YAP 的表達。蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR顯示核YAP的表達在循環(huán)拉伸應力下增加。當整合素αVβ3的表達受到抑制時，蛋白質(zhì)印跡顯示核YAP的表達低于CTS組。免疫熒光結(jié)果顯示，在循環(huán)拉應力作用下，核YAP的表達明顯增加。此外還發(fā)現(xiàn)，當整合素 αVβ3 被抑制時，核 YAP 的表達降低。這些結(jié)果表明，循環(huán)拉伸應力通過整合素αVβ3上調(diào)核YAP。

當細胞松弛素D 抑制 β-肌動蛋白的聚合時，蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光顯示核 YAP 的表達在循環(huán)拉伸應力下降低。蛋白質(zhì)印跡還顯示，在維替泊芬存在下，在循環(huán)拉伸應力下ALP和RUNX2的表達降低。上述實驗表明，在成骨分化早期，循環(huán)拉伸應力通過整合素αVβ3-微絲軸調(diào)節(jié)核YAP。

循環(huán)拉伸應力促進成骨過程中粘著斑的形成和 FAK 磷酸化

由肌動蛋白絲和整合素形成的粘著斑需要踝蛋白（talin）、FAK 和紐蛋白（vinculin）才能將 CTS 傳遞到基底。實驗檢測了 talin-1、FAK 和 vinculin 的表達，以探索它們與整合素 αVβ3 的關聯(lián)。蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR顯示在循環(huán)拉伸應力下talin-1、FAK和vinculin的表達增加（圖3 a、b）。蛋白質(zhì)印跡顯示，當整合素αVβ3的表達被c（RGDyk）或shRNA抑制時，talin-1，FAK和vinculin的表達降低（圖3 c、e）。qRT-PCR 獲得了類似的結(jié)果（圖3 d、f）。免疫熒光顯示，紐蛋白在循環(huán)拉伸應力下的可見粘著斑斑塊中表達和定位更高。整合素αVβ3的抑制與紐蛋白表達的顯著降低相關（圖3 g）。這些結(jié)果表明，循環(huán)拉伸應力通過整合素αVβ3促進粘著斑的形成。

接下來，研究了 FAK 磷酸化在循環(huán)拉伸應力下在成骨分化中的作用。蛋白質(zhì)印跡顯示FAK的磷酸化響應于循環(huán)拉伸應力而增加，并且整合素αVβ3的抑制下調(diào)了FAK的磷酸化（圖3 h、i）。實驗發(fā)現(xiàn)，當 FAK 的磷酸化被 Y-15（一種小分子抑制劑）抑制時，ALP 和 RUNX2 的表達降低（圖3 j）。這些結(jié)果表明，FAK不僅參與了含有整合素αVβ3的粘著斑的形成，而且FAK的磷酸化有助于循環(huán)拉伸應力誘導的成骨分化的早期階段。

圖3   CTS 誘導的整合素 αVβ3 激活調(diào)節(jié)粘著斑相關蛋白和 FAK 的磷酸化，以促進成骨分化的早期階段。

（a）talin-1、FAK 和 vinculin 的蛋白質(zhì)表達在 CTS 下 4 天和 7 天。（b）talin-1、FAK和vinculin mRNA表達在CTS下4天和7天。（c）GM 和 RGDyk 組中 CTS 下 talin-1、FAK 和 vinculin 的蛋白質(zhì)表達。（d）GM 和 RGDyk 組在 CTS 下 talin-1、FAK 和 vinculin 的 mRNA 表達。（e）在 CTS 下 GM、NC、shRNA-整合素αV 和 shRNA-整合素 β3 組中 talin-1、FAK 和 vinculin 的蛋白質(zhì)表達。（f）GM、NC、shRNA-整合素αV和shRNA-整合素β3組在CTS下talin-1、FAK和vinculin的mRNA表達。（g） GM、CTS、NC、shRNA-integrin αV 和 shRNA-integrin β3 組在 CTS 下的 vinculin 免疫熒光 7 天。（h） CTS 下 FAK 磷酸化水平 7 天。（i）CTS 下 GM、NC、shRNA-整合素 αV 和 shRNA-整合素 β3 組中 FAK 的磷酸化水平。（j）CTS下CTS組和Y15組ALP和RUNX2蛋白表達。

循環(huán)拉伸應力通過整合素αVβ3的激活對成纖維細胞早期成骨分化產(chǎn)生積極影響，導致微絲細胞骨架的重排。此外，循環(huán)拉伸應力刺激的肌動蛋白絲的重排和 FAK 的磷酸化通過整合素 αVβ3 導致人成纖維細胞中核 YAP 的表達增加。在未來的研究中，整合素αVβ3應該被認為是體內(nèi)實驗的一個有希望的靶點，以驗證其促進骨修復的功能。

參考文獻：Peng Y, Qu R, Feng Y, Huang X, Yang Y, Fan T, Sun B, Khan AU, Wu S, Dai J, Ouyang J. Regulation of the integrin αVβ3- actin filaments axis in early osteogenesis of human fibroblasts under cyclic tensile stress. Stem Cell Res Ther. 2021 Oct 7;12(1):523. doi: 10.1186/s13287-021-02597-y. PMID: 34620239; PMCID: PMC8496073.

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