肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，在組織學(xué)上分為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（SCLC），NSCLC 進(jìn)一步細(xì)分為腺癌（ADC）、鱗狀細(xì)胞癌（SCC）和其他不太常見的亞型，例如大細(xì)胞癌（LCC）。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（TAFs），是基質(zhì)細(xì)胞類型，研究表明，非小細(xì)胞肺癌中的 TAFs 根據(jù)其來源腫瘤的組織學(xué)亞型表現(xiàn)出不同的表型改變，這表明TAFs促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制可能與癌癥亞型有關(guān)。

在TAFs 中，獲得的衰老表型正在成為主要的腫瘤促進(jìn)過程。衰老細(xì)胞還可以表現(xiàn)出促炎因子和其他可溶性因子的分泌增加，稱為衰老相關(guān)分泌表型（SASP）。值得注意的是，已經(jīng)在幾種實體瘤中發(fā)現(xiàn)了衰老的 TAFs，其中侵襲性腫瘤進(jìn)展與衰老 TAFs 的 SASP 有關(guān)。LCC 腫瘤通常表現(xiàn)出侵襲性腫瘤表型，從 LCC 患者中分離出來的 TAFs 更有可能衰老，這表明 LCC-TAFs 的衰老可能與 LCC 腫瘤的侵襲性和增殖性特征增強有關(guān)。

西班牙巴塞羅那大學(xué)醫(yī)學(xué)與健康科學(xué)學(xué)院、美國梅奧診所癌癥生物學(xué)系、意大利IRCCS國家腫瘤研究所等研究團(tuán)隊的一項工作發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP1）是成纖維細(xì)胞旁分泌衰老的關(guān)鍵 LCC 分泌因子，并隨后增強腫瘤促進(jìn)特性。這些結(jié)果確立了 MMP1 在癌癥中的全新作用，并在LCC進(jìn)展中定義了致瘤性衰老成纖維細(xì)胞的 MMP1 依賴性旁分泌激活的新模式。此外，基于靶向衰老的成纖維細(xì)胞確定了一種針對這種知之甚少的癌癥類型的新治療策略。

MMP1 在 LCC 細(xì)胞系中選擇性過表達(dá)，是衰老成纖維細(xì)胞旁分泌誘導(dǎo)所必需的

為了確定 LCC 細(xì)胞分泌的誘導(dǎo)共培養(yǎng)成纖維細(xì)胞衰老的因子，實驗評估了一組隨機(jī)選擇的培養(yǎng) LCC（H460、H661）和非 LCC 細(xì)胞系（ADC 和 SCC：H1437、 H358、H1703、A549 和 H23）。通過 qRT-PCR 證實，H460 和 H661 LCC 細(xì)胞中的MMP1過表達(dá)。

為了評估 LCC 細(xì)胞表達(dá)MMP1是否是誘導(dǎo)共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞衰老所必需的，使用兩種不同的質(zhì)粒通過 shRNA 敲低了三種 LCC 細(xì)胞系（H460、H1299 和 H661）中的MMP1表達(dá)，Scr 是用作對照，并分析了三種標(biāo)準(zhǔn)衰老標(biāo)志物：衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（SA-βgal）的誘導(dǎo)、性生長停滯和細(xì)胞周期抑制劑CDKN2A（p16 INK4a）在與MMP1表達(dá)減少的LCC系共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。最終發(fā)現(xiàn)表明，MMP1在 LCC 細(xì)胞中的表達(dá)是成纖維細(xì)胞衰老的旁分泌誘導(dǎo)的原因。

LCC 細(xì)胞中的 MMP1 敲低消除了共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的促腫瘤作用，并損害了體內(nèi)腫瘤的生長

之前表明，來自與 LCC 細(xì)胞系共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基（CM）可增強 LCC 細(xì)胞的生長和侵襲。在這里，實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用來自與 shMMP1 LCC 細(xì)胞（H460、H1299）共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的 CM 時，這種效果會大大減弱（圖1 A-D），并且在與 H661 細(xì)胞的共培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。

細(xì)胞因子IL6和IL8被認(rèn)為是衰老細(xì)胞分泌組或 SASP的關(guān)鍵元素，并且在與感染對照（Scr）慢病毒的 H460 和 H1299 細(xì)胞共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中，IL6和IL8在 mRNA 水平和作為分泌蛋白顯著上調(diào)（圖1 E-H），與衰老表型一致。然而，這種上調(diào)隨著 H460 細(xì)胞的 MMP1 的敲低而顯著減弱（圖1 E、G），但在H1299（圖1 F、H）或H661細(xì)胞系中效果不很明顯，表明通過與表達(dá)MMP1的LCC細(xì)胞共培養(yǎng)增強的衰老成纖維細(xì)胞的促腫瘤特性與除IL6和IL8之外的SASP因子相關(guān)。

接下來，在帶有 MMP1 敲低的 H460 細(xì)胞的腫瘤異種移植物中，LCC 細(xì)胞的MMP1 mRNA 仍顯著下調(diào)。與體外研究結(jié)果一致，與親本細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)在攜帶 shMMP1 細(xì)胞的腫瘤中腫瘤生長和腫瘤吸收顯著減少。此外還觀察到，與對照 H460 細(xì)胞相比，來自 shMMP1 H460 細(xì)胞的腫瘤表現(xiàn)出更少的衰老成纖維細(xì)胞。這些觀察結(jié)果強烈支持，LCC 細(xì)胞中的MMP1是促腫瘤的衰老成纖維細(xì)胞異常積累所必需的。

圖2   LCC細(xì)胞中MMP1在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞促腫瘤作用中的效應(yīng)。

重組 MMP1（rMMP1）在共培養(yǎng)中部分挽救成纖維細(xì)胞衰老及其增強的促腫瘤特性

實驗接下來評估了MMP1是否足以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老和/或增強衰老成纖維細(xì)胞分泌組的促腫瘤特性。對照成纖維細(xì)胞使用 45 U/ml 活性 rMMP1 暴露 7 天并沒有顯著增加 SA-βgal+ 成纖維細(xì)胞的比例（圖2 A）或 SASP 標(biāo)志物IL6和IL8的 mRNA 表達(dá)（圖2 B、C）。一致地，單獨用 rMMP1 處理的成纖維細(xì)胞的 CM 并沒有增加 H460（圖2 D、F）或 H1299（圖2 E、G）的生長和侵襲，甚至降低了 H460 的侵襲。然而，將 45 U/ml rMMP1 添加到與 shMMP1 H460 或 H1299 細(xì)胞共培養(yǎng)的對照成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基中（圖2 H）顯著增加了 SA-βgal 陽性（圖2 I、J）。補充 rMMP1 也挽救了 shMMP1 H460 或 H1299 誘導(dǎo)共培養(yǎng)成纖維細(xì)胞 CM 的生長和侵襲促進(jìn)作用的能力（圖2 K-N）。這些結(jié)果表明，單獨的 rMMP1 不足以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老或增強其 CM 的促腫瘤特性，并支持了它需要輔因子。

圖2   重組 MMP1（rMMP）對成纖維細(xì)胞衰老和促腫瘤性狀的影響。

結(jié)合 rMMP1 和 TGF-β1 足以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老和促腫瘤作用

因為來自 LCC 患者的 TAFs 表現(xiàn)出激活/肌成纖維細(xì)胞樣表型，而 TGF-β1 是一種已知的成纖維細(xì)胞激活劑，在 NSCLC 中經(jīng)常上調(diào)，并且與衰老有關(guān)，實驗檢查了rMMP1與TGF-β1組合對對照肺成纖維細(xì)胞的影響。最終觀察結(jié)果揭示了MMP1 和 TGF-β1 之間的一種新的相互作用，它引發(fā)了成纖維細(xì)胞衰老，同時增強了它們在 LCC 細(xì)胞上的分泌組的促腫瘤特性。

為了進(jìn)一步說明 TGF-β1 在 LCC 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞衰老中的作用，首先在 Sanger 數(shù)據(jù)庫中的一組擴(kuò)展細(xì)胞系中檢測了TGFB1 mRNA ，發(fā)現(xiàn)與非 LCC 系相比，LCC 中TGF-β1 顯著上調(diào)。接下來，使用 CAGA 報告基因在共培養(yǎng)實驗中檢查了分泌的 TGF-β1 的生物活性，發(fā)現(xiàn)與裸對照相比，與 H460 LCC 細(xì)胞共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞顯著增加，同時伴隨成纖維細(xì)胞活化標(biāo)志物COL1A1和α-SMA的表達(dá)增加。這些結(jié)果強烈支持在 LCC 細(xì)胞中選擇性地存在異常大的 TGF-β1 表達(dá)。

氧化應(yīng)激和 F2R（PAR-1）參與了 rMMP1 和 TGF-β1 在成纖維細(xì)胞中的促衰老和促腫瘤作用

為了開始揭示由 rMMP1 和 TGF-β1 共同刺激引起的成纖維細(xì)胞衰老的機(jī)制，實驗使用了三種互補策略，其中檢查了氧化應(yīng)激的作用。首先通過 SA-βgal+ 細(xì)胞（圖3 A）和 SASP 因子IL6和IL8的表達(dá)（圖3 B、C），證實 NAC 在與 H460 共培養(yǎng)時減弱了成纖維細(xì)胞衰老。此外，發(fā)現(xiàn) NAC 顯著減弱了由 rMMP1 和 TGF-β1 共同刺激引起的 SA-βgal+ 成纖維細(xì)胞的增加（圖3 D），相應(yīng)的 CM 顯著降低了H460 細(xì)胞的生長（圖3 E）和侵襲（圖3 F），表明氧化應(yīng)激在 LCC 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞衰老和隨后的促腫瘤分泌組激活中都有作用。

最后分析了蛋白酶激活受體 PAR-1 的作用，它是一種 G 蛋白偶聯(lián)受體，先前參與了由F2R基因編碼的基質(zhì)細(xì)胞中MMP1下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。有趣的是，通過與 rMMP1 和 TGF-β1 共刺激或與 H460 細(xì)胞共培養(yǎng)來誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老，始終下調(diào)F2R（PAR-1）mRNA（圖3 G) 和相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)（圖3 H），而這種下調(diào)在與 shMMP1 H460 細(xì)胞共培養(yǎng)時被消除（圖3 I）。同樣，通過 siRNA 迫使對照成纖維細(xì)胞中的F2R下調(diào)（圖3 J），與 siControl相比（圖3 K），在與H460細(xì)胞共培養(yǎng)時，SA-βgal+成纖維細(xì)胞的表達(dá)增加類似（圖3 K），甚至衰老標(biāo)志物IL6和IL8的表達(dá)量也更高（圖3 L、M），暗示更強的衰老表型。這些結(jié)果強烈支持在 rMMP1 和 TGF-β1 下游引起的F2R下調(diào)可能與它們對成纖維細(xì)胞衰老的誘導(dǎo)有關(guān)。圖3 N總結(jié)了所有這些機(jī)制的見解。

圖3   成纖維細(xì)胞中由rMMP1和TGF-β1引起的促衰老和促腫瘤作用的機(jī)制研究。

總之，該研究結(jié)果支持 LCC 細(xì)胞通過 MMP1 和 TGF-β1 的異常分泌引發(fā)腫瘤支持生態(tài)位，從而誘導(dǎo)相鄰成纖維細(xì)胞衰老。衰老 TAFs 的這種異常增加可能至少部分是 LCC 侵襲性的基礎(chǔ)，因為衰老成纖維細(xì)胞增強了 LCC 細(xì)胞的生長和侵襲，超出了非衰老成纖維細(xì)胞引起的范圍，因此，在未來對這種罕見疾病的研究中測試抗衰老藥物的可能性令人興奮。

參考文獻(xiàn)：Gabasa M, Radisky ES, Ikemori R, Bertolini G, Arshakyan M, Hockla A, Duch P, Rondinone O, Llorente A, Maqueda M, Davalos A, Gavilán E, Perera A, Ramírez J, Gascón P, Reguart N, Roz L, Radisky DC, Alcaraz J. MMP1 drives tumor progression in large cell carcinoma of the lung through fibroblast senescence. Cancer Lett. 2021 Jun 1;507:1-12. doi: 10.1016/j.canlet.2021.01.028. Epub 2021 Mar 6. PMID: 33684534; PMCID: PMC8026696.

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