人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）可以從牙周膜中分離出來，牙周膜是牙根和相鄰牙槽骨之間的連接纖維組織。迄今為止，hPDLSCs 已表現(xiàn)出間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的特征，因為它們具有自我更新和分化的潛力。hPDLSCs 的治療潛力不僅體現(xiàn)在牙周組織中，還體現(xiàn)在其他組織中，如牙槽骨。

從免疫調(diào)節(jié)的角度來看，hPDLSCs 具有顯著的特征，使其能夠逃避免疫識別，抑制激活的免疫細(xì)胞功能并在組織再生過程中調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子。旁分泌免疫抑制細(xì)胞因子，包括吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）、白細(xì)胞介素10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1），具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的行為。

轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1) 在 MSCs 和牙周韌帶（PDL）細(xì)胞中組成型表達。它在激活前以潛伏形式分泌，與細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白結(jié)合。除了調(diào)節(jié)組織穩(wěn)態(tài)外，TGF-β1 可以抑制 T 細(xì)胞增殖和活化以及促進調(diào)節(jié)性 CD4+ T（Treg）細(xì)胞的分化。吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）是催化 L-Tryptophan 向 N-甲?；虬彼徂D(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)酶。通過 IDO-犬尿氨酸途徑耗竭的色氨酸通過抑制 T 細(xì)胞增殖和促進 Treg 分化來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。

在牙周組織中，PDL 細(xì)胞在牙齒移動過程中受到間質(zhì)液流體剪切應(yīng)力的影響。剪切應(yīng)力已被證明在多種細(xì)胞類型的細(xì)胞行為中發(fā)揮重要作用，包括胚胎干細(xì)胞、骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、MSCs 以及 PDL 細(xì)胞。以前，體外剪切應(yīng)力刺激（3-15 dyn/cm²）被證明可以調(diào)節(jié) PDL 細(xì)胞特性，例如成骨分化、細(xì)胞增殖和 ECM 重塑。此外，剪切應(yīng)力有可能通過 COX2/PGE2 表達增強 MSCs 的免疫抑制作用。

然而，尚未闡明剪切應(yīng)力對觸發(fā) hPDLSCs 免疫調(diào)節(jié)特性的影響?；诖?，泰國朱拉隆功大學(xué)牙科學(xué)院解剖學(xué)系的課題組評估了剪切應(yīng)力對 hPDLSCs 免疫抑制特性的影響，研究了剪切應(yīng)力激活的免疫抑制分子對CD4⁺ T 細(xì)胞增殖和 Treg 分化的影響。研究表明，使用 hPDLSCs 的機械刺激作為一種有前途的方法來誘導(dǎo)免疫抑制，同時用同種異體療法靶向組織再生。

剪切應(yīng)力增強免疫抑制調(diào)節(jié)劑的表達

實驗首先使用 CCK-8 測定法確定剪切應(yīng)力對 hPDLSC 活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有大小的剪切應(yīng)力（0.5-10 dyn/cm²）對細(xì)胞活力沒有顯著影響，這由 hPDLSCs 的線粒體活性表明。

為了確定剪切應(yīng)力是否刺激 hPDLSCs 中免疫調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)劑的表達，細(xì)胞受到 0.5、5、10 dyn/cm² 的剪切應(yīng)力刺激 3h 后連續(xù)培養(yǎng)至 24h。收集細(xì)胞用于 mRNA 表達分析，包括 IDO、TGF-β1、COX2 和 IFN-γ。結(jié)果表明，5 dyn/cm² 處的應(yīng)力顯著增加 hPDLSCs 中 IDO（圖1 A）和 COX2（圖1 D）的基因表達，而 IFN-γ（圖1 C）和 TGF-β1（圖1 B）的表達沒有顯著差異。

圖1 剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 hPDLSCs 中免疫抑制調(diào)節(jié)因子的 mRNA 表達。剪切應(yīng)力刺激后，采用 qRT-PCR 檢測 IDO（A ）、TGF-β1（B）、IFN-γ（C）和 COX2（D）的 mRNA 相對表達量。

實驗進一步研究了在剪切應(yīng)力刺激后所有條件培養(yǎng)基中的 IDO 和犬尿氨酸（kynurenine）產(chǎn)物的活性（圖 2 A、B）。與非剪切應(yīng)力衍生的條件培養(yǎng)基（CTL-CM）相比，剪切應(yīng)力衍生條件培養(yǎng)基（SS-CM）中 IDO 活性在 5、10 dyn/cm² 下增加（圖2 A）。隨后，5 dyn/cm² 時，SS-CM 中犬尿氨酸的產(chǎn)物量顯著高于 CTL-CM（圖2 B）。

關(guān)于 TGF-β1，實驗在條件培養(yǎng)基中測定 TGF- β1 活性。雖然 5 dyn/cm² 剪切應(yīng)力下，總 TGF-β1的分泌增加，但與 CTL-CM 相比，在所有剪切應(yīng)力強度（0.5、5 和 10 dyn/cm²）下，SS-CM 中 TGF-β1 活性均增加（圖2 C）。相比之下，與對照相比，剪切應(yīng)力在 5 dyn/cm² 時降低了細(xì)胞裂解液中 TGF-β1 的活性形式，但對TGF-β1 的潛伏形式?jīng)]有影響（圖2 D-F）。

使用 ELISA 測定法測量細(xì)胞裂解物和條件培養(yǎng)基中 IFN-γ 的濃度。該測定顯示，與對照相比，在所有剪切應(yīng)力強度下，細(xì)胞結(jié)合的 IFN-γ 數(shù)量均無差異（圖2 G）。相反，在 0.5 和1 0 dyn/cm² 下 IFN-γ 的分泌量降低（圖2 H）。

至于 COX2 表達，分析了不同剪切應(yīng)力強度下 hPDLSCs 中 COX2 依賴性 PGE2 的合成。結(jié)果顯示，與 CTL-CM 相比，所有 SS-CM 組的 PGE2 產(chǎn)物沒有差異（圖2 I）。

這些表明，5 dyn/cm² 的剪切應(yīng)力可以*佳地增強 IDO、犬尿氨酸和 TGF-β1 基因/蛋白的表達。

圖2 剪切應(yīng)力誘導(dǎo) hPDLSCs 中免疫抑制調(diào)節(jié)因子的蛋白質(zhì)表達。剪切應(yīng)力促進了 hPDLSCs 中 IDO 活性（A）和犬尿氨酸產(chǎn)物（B）。剪切應(yīng)力增加了 PDLSCs 衍生的條件培養(yǎng)基中活性 TGF-β1 的分泌（C）。蛋白質(zhì)印跡分析hPDLSCs 中 TGF-β1 蛋白表達（D）。蛋白質(zhì)印跡定量分析潛伏性 TGF-β1（E）和活性 TGF-β1的條帶強度（F）。ELISA 測定法測定細(xì)胞裂解液（G）和條件培養(yǎng)基（H ）中 IFN-γ 的含量和不依賴 COX2 的 PGE2 的量（I）。

剪切應(yīng)力通過 ERK1/2 信號通路增強 IDO 活性的產(chǎn)物

為了研究剪切應(yīng)力增強 IDO 表達的調(diào)節(jié)機制和 hPDLSC 衍生條件培養(yǎng)基中犬尿氨酸的量，在剪切應(yīng)力刺激（5 dyn/cm²）前用蛋白質(zhì)合成抑制劑亞胺環(huán)己酮（CHX）預(yù)處理細(xì)胞 1h。與對照相比，CHX 減弱了 IDO 的表達和犬尿氨酸的量（圖3 A、B）。該結(jié)果表明，有中間分子參與了 hPDLSCs 中剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 IDO 基因表達的調(diào)節(jié)機制。

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）的作用被證明與人類樹突狀細(xì)胞的免疫抑制特性的激活有關(guān)。因此接下來研究了剪切應(yīng)力是否通過激活 ERK1/2 調(diào)節(jié) IDO-犬尿氨酸和 TGF-β1 的分泌。hPDLSCs 用 ERK 抑制劑預(yù)處理 1h，隨后置于 5 dyn/cm² 的剪切應(yīng)力下 3h。在對照條件下，細(xì)胞在沒有用 ERK 抑制劑預(yù)處理的情況下接受 3h 的剪切應(yīng)力。蛋白質(zhì)印跡檢測剪切應(yīng)力對 ERK1/2 和磷酸化 ERK1/2（P-ERK1/2）蛋白表達的影響。剪切應(yīng)力誘導(dǎo) hPDLSCs 的 ERK1/2 磷酸化，這種磷酸化被 ERK 抑制劑消除（圖3 C-E）。在 ERK 抑制劑存在的情況下，剪切應(yīng)力對 hPDLSCs 中犬尿氨酸含量的影響也減弱了（圖3 F），但 TGF-β1 及其活性形式?jīng)]有減弱（圖3 G）。因此，剪切應(yīng)力通過激活 ERK1/2 信號通路增強 hPDLSCs 中犬尿氨酸的分泌。

圖3 剪切應(yīng)力通過 ERK1/2 信號通路增強 hPDLSCs 中的 IDO 表達和 IDO 分解代謝的犬尿氨酸產(chǎn)物。剪切應(yīng)力刺激后（5 dyn/cm²），CHX 處理的 hPDLSCs 中檢查 IDO mRNA 表達和犬尿氨酸產(chǎn)物（A、B）。通過蛋白質(zhì)印跡分析檢查 ERK1/2 的活性（C）。Western blot 條帶強度的定量分析表明，ERK 抑制劑減弱了剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 hPDLSCs 中 P-ERK1/2（D）的表達，但不減弱 ERK1/2 的表達（E）。添加 ERK 抑制劑可抑制剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的犬尿氨酸分泌（F）。然而，剪切應(yīng)力不影響 TGF-β1 分泌（G）。

剪切應(yīng)力衍生條件培養(yǎng)基（SS-CM）抑制 T 細(xì)胞增殖

接下來評價了 SS-CM 對 PBMCs 中 CD4⁺ T 細(xì)胞增殖的抑制作用，CTL-CM 用作對照。T 細(xì)胞活化后，活化的 T 細(xì)胞顯著形成簇狀，細(xì)胞體積增加，數(shù)量增加。與沒有條件培養(yǎng)基處理的活化 T 細(xì)胞相比，用 CTL-CM 和 SS-CM 處理后 T 細(xì)胞增殖顯著降低。此外，SS-CM 中 T 細(xì)胞的增殖明顯低于 CTL-CM（圖4 A）。這表明，源自 hPDLSCs 的條件培養(yǎng)基抑制了 T 細(xì)胞的增殖，并且這種效應(yīng)可以通過剪切應(yīng)力刺激來增強。

圖4 剪切應(yīng)力減弱 CD4⁺ T細(xì)胞增殖并促進 Treg 分化。所有 hPDLSC 衍生的條件培養(yǎng)基均與 CD4⁺ T細(xì)胞間接共培養(yǎng)。CD4⁺ T 細(xì)胞的增殖使用 resazurin 測定法評估。SS-CM 降低了 T 細(xì)胞增殖的百分比（A）。在 SS-CM 處理的 CD4⁺ T細(xì)胞中，FOXP3（B）和 IL-10（C）的 mRNA 表達上調(diào)。流式細(xì)胞儀分析顯示 與 CTL-CM 和激活的 T 細(xì)胞相比，SS-CM 中 CD4⁺CD25^hi CD127^lo/− Treg 細(xì)胞數(shù)量百分比增加（D、E）。

剪切應(yīng)力衍生條件培養(yǎng)基（SS-CM）誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞分化

為了進一步研究 SS-CM 是否誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞的發(fā)育，將活化的 T 細(xì)胞與 SS-CM 共培養(yǎng) 5 天。Treg 細(xì)胞的特征在于 Treg 特異性基因標(biāo)志物 FOXP3 和 IL-10。結(jié)果表明，與活化的 T 細(xì)胞和 CTL-CM 相比，SS-CM中 FOXP3 的 mRNA 表達顯著增加（圖4 B）。與活化的 T 細(xì)胞相比，CTL-CM 和 SS-CM 中 IL-10 的表達上調(diào)。然而，IL-10 的 mRNA 表達在 CTL-CM 和 SS-CM 之間沒有差異（圖4 C）。先前的一項研究表明，CD4⁺CD25^hi CD127^lo/− 是功能性 Treg 群體的有效純度標(biāo)記。該研究表明，與激活的 T 細(xì)胞和 CTL-CM 相比，SS-CM 增加了CD4⁺CD25^hi CD127^lo/− Treg 細(xì)胞的比例（圖4 D、E）。因此，這些結(jié)果表明，源自剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 hPDLSCs 的條件培養(yǎng)基可增強 Treg 特異性標(biāo)志物（FOXP3 和 IL-10）的 mRNA 表達并增加 Treg 細(xì)胞群數(shù)量。

圖5 剪切應(yīng)力通過 ERK 誘導(dǎo)的 IDO 和TGF-β1活性激活 hPDLSCs 的免疫抑制能力示意圖。剪切應(yīng)力通過 ERK1/2 激活增強 hPDLSCs 中 IDO 依賴性犬尿氨酸，并增加細(xì)胞外基質(zhì)或條件培養(yǎng)基中 TGF-β1 總量和活性。犬尿氨酸和 TGF-β1 分泌增加抑制 CD4⁺ T 細(xì)胞增殖和促進 Treg 細(xì)胞分化。

總之，該研究結(jié)果表明，剪切應(yīng)力通過 ERK1/2 信號通路增強 hPDLSCs 中的犬尿氨酸。響應(yīng)剪切應(yīng)力，hPDLSCs 分泌活性 TGF-β1 和犬尿氨酸，從而抑制 T 細(xì)胞增殖并促進 Treg 分化（圖5）。研究結(jié)果有助于更好地理解 hPDLSCs 對機械刺激（例如牙齒運動過程中產(chǎn)生的機械刺激）的免疫抑制特性?？梢韵嘈?，hPDLSCs 的旁分泌介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)功能可能是一種有前途的臨床應(yīng)用方法，特別是在同種異體細(xì)胞治療的情況下。

參考文獻：Suwittayarak R, Klincumhom N, Ngaokrajang U, Namangkalakul W, Ferreira JN, Pavasant P, Osathanon T. Shear Stress Enhances the Paracrine-Mediated Immunoregulatory Function of Human Periodontal Ligament Stem Cells via the ERK Signalling Pathway. Int J Mol Sci. 2022 Jun 27;23(13):7119. doi: 10.3390/ijms23137119. PMID: 35806124; PMCID: PMC9266779.

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