根據(jù)血流形態(tài)和位置的不同，流體剪切應(yīng)力有不同的表現(xiàn)形式。例如，當(dāng)血液在血管的直線部分流動(dòng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生層流剪切應(yīng)力（Lss），但當(dāng)血液流過(guò)血管分支、分叉或彎曲時(shí)，會(huì)產(chǎn)生振蕩剪切應(yīng)力或湍流。大量研究證實(shí)，動(dòng)脈粥樣硬化（AS）在直血管中的發(fā)生率較低，而血管分叉處和彎曲處的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生率較高。因此，Lss 具有重要的抗 AS 作用。

CX3CL1 是由 373 個(gè)氨基酸組成的大分子蛋白，是目前已知的 CX3C 是趨化因子家族中的成員。研究報(bào)道，低剪切應(yīng)力通過(guò)激活 CX3CL1 誘導(dǎo)單核細(xì)胞與 TNF-α（也稱為 TNF）激活的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的粘附，而生理剪切應(yīng)力消除了這種內(nèi)皮炎癥。通過(guò)分析高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn) CX3CL1 在 Lss 處理的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)水平較低。因此，進(jìn)一步的研究需要揭示 Lss 通過(guò)降低 CX3CL1 表達(dá)來(lái)抑制 AS 進(jìn)展。

MicroRNAs（miRNAs）是一種長(zhǎng)度約為 22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈 RNA，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控。研究提出，Lss 通過(guò)調(diào)節(jié) miRNAs 來(lái)維持內(nèi)皮細(xì)胞功能的穩(wěn)定，從而發(fā)揮抗 AS 作用。有鑒于此，需要探討 Lss 敏感的 miR-29b-3p 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能和 AS 形成的影響。

吉林大學(xué)人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系、吉林大學(xué)第一醫(yī)院心血管疾病診治中心的聯(lián)合團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究結(jié)合生物信息學(xué)、分子生物學(xué)和其他研究方法檢測(cè)了 Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 軸，在體外和體內(nèi)探討了該軸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和 AS 發(fā)生發(fā)展的影響，從而提高了對(duì) AS 調(diào)控的認(rèn)識(shí)，為 AS 的防治提供了新的思路和見(jiàn)解。

為了探索 Lss 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，實(shí)驗(yàn)確定了在 Lss（12 dyn/cm²）處理的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAECs）和 HUVECs 中下調(diào)的 25 個(gè) mRNAs 作為關(guān)鍵 mRNAs。

有研究報(bào)道，CXCR4、APLN、CX3CL1、CSF1 和 HES1 參與 AS 的發(fā)生和發(fā)展。因此，使用定量實(shí)時(shí) PCR（qRT-PCR）來(lái)測(cè)量靜態(tài)和 Lss 處理的 HAECs 中 CXCR4、APLN、CX3CL1、CSF1 和 HES1 的 mRNA 表達(dá)。鑒于CX3CL1 mRNA 表達(dá)降低尤為顯著，于是將 CX3CL1 確定為后續(xù)研究的靶基因。與 HUVECs-static 組相比， HUVECs-Lss 組 CX3CL1 的 mRNA 表達(dá)也降低，與實(shí)驗(yàn)中生物合成分析結(jié)果一致。

這表明，Lss 可以降低內(nèi)皮細(xì)胞中 CX3CL1 mRNA 和蛋白表達(dá)，所以 CX3CL1 是 Lss 敏感基因。

研究報(bào)道，內(nèi)皮 CX3CL1 誘導(dǎo)單核細(xì)胞粘附，從而破壞血管內(nèi)皮功能。qRT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡顯示，與陰性對(duì)照組相比，TNF-α 誘導(dǎo) HAECs 中 CX3CL1、血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）和細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）的 mRNA 和蛋白表達(dá)增加。然而，在轉(zhuǎn)染 sh-CX3CL1-1 后，CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 的表達(dá)受到抑制（圖1 B-D）。此外，降低的 CX3CL1 表達(dá)抑制了 TNF-α 刺激的單核細(xì)胞粘附的增強(qiáng)（圖1 E、F）。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了 Lss 是否通過(guò)調(diào)節(jié) CX3CL1 表達(dá)影響內(nèi)皮細(xì)胞功能。HAECs 轉(zhuǎn)染 CX3CL1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pri-CX3CL1）后，CX3CL1 的 mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)，說(shuō)明 CX3CL1 過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型成功建立（圖1 G ）。

如圖1 H-J 所示，Lss 顯著抑制 TNF-α 刺激的 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 mRNA 和蛋白表達(dá)的增加，上調(diào) CX3CL1 的表達(dá)逆轉(zhuǎn)了 Lss 的抑制作用。此外，對(duì)單核細(xì)胞粘附的分析表明，CX3CL1 的過(guò)表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了 Lss 對(duì) TNF-α 刺激的單核細(xì)胞粘附增強(qiáng)的抑制作用（圖1 K、L）。

這表明，Lss 通過(guò)抑制 CX3CL1 表達(dá)損害單核細(xì)胞對(duì)活化 HAECs 的粘附。

圖1 Lss 通過(guò)抑制 CX3CL1 的表達(dá)，損害單核細(xì)胞對(duì)活化 HAECs 的粘附。

最近的研究表明，受流體剪切應(yīng)力調(diào)控的 miRNAs 是治療心血管疾病的潛在靶點(diǎn)。因此，為了分析 Lss 依賴性保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能的分子機(jī)制，研究檢測(cè)了響應(yīng) Lss 調(diào)節(jié) CX3CL1 表達(dá)的上游 miRNAs。

qRT-PCR 顯示，與 HAECs-static 組相比，Lss 尤為顯著上調(diào)了 miR-29b-3p 的表達(dá)。進(jìn)一步驗(yàn)證表明，過(guò)表達(dá) miR-29b-3p 抑制 CX3CL1 mRNA 和蛋白表達(dá)，而敲低 miR-29b-3p 則促進(jìn) CX3CL1 mRNA 和蛋白表達(dá)。

這表明，CX3CL1 是 miR-29b-3p 的直接靶點(diǎn)。

隨后，研究探討了 miR-29b-3p 是否在 TNF-α 激活的 HAECs 中調(diào)節(jié) CX3CL1 的表達(dá)。qRT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡顯示，miR-29b-3p 過(guò)表達(dá)顯著抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的 CX3CL1 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)升高（圖2 B-D）。此外，miR-29b-3p 過(guò)表達(dá)還顯著抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的 VCAM-1 和 ICAM-1 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)的增加，以及單核細(xì)胞粘附的增強(qiáng)（圖2 E-I）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證 miR-29b-3p 是否通過(guò)調(diào)節(jié) CX3CL1 表達(dá)抑制單核細(xì)胞粘附到活化的 HAECs，將 pri-miR-29b-3p 和 pri-CX3CL1 共轉(zhuǎn)染到 TNF-α 激活的 HAECs 中。如圖2 J-L，在 TNF-α 激活的 HAECs 中，CX3CL1 的過(guò)表達(dá)消除了 miR-29b-3p 對(duì) CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制作用。此外，miR-29b-3p 過(guò)表達(dá)顯著抑制單核細(xì)胞與 TNF-α 激活的 HAECs 的粘附，而 CX3CL1 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了這種抑制作用（圖2 M、N）。

鑒于 miR-29b-3p 是 Lss 敏感的 miRNA，還探討了在加載 Lss 的條件下，miR-29b-3p 敲低對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響。如圖2 O-Q，在加載 Lss 后，TNF-α 上調(diào)的 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)受到抑制，而 miR-29b-3p 的敲低則逆轉(zhuǎn)了這種抑制作用。同樣，miR-29b-3p 敲低也逆轉(zhuǎn)了 Lss 對(duì)單核細(xì)胞粘附到 TNF-α 激活的 HAECs 的抑制作用（圖2 R、S）。

這表明，Lss 通過(guò)調(diào)控 miR-29b-3p/CX3CL1 軸損害單核細(xì)胞對(duì)活化的 HAECs 的粘附。

圖2 Lss 通過(guò)調(diào)控 miR-29b-3p/CX3CL1 軸損害單核細(xì)胞與活化的 HAECs 的粘附。在存在或不存在 TNF-α（10 ng/ml）的情況下，用 pri-miR-29b-3p 或陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染 HAECs。

有研究提出，一些內(nèi)皮 miRNAs 通過(guò)調(diào)節(jié) NF-κB 信號(hào)通路來(lái)控制細(xì)胞粘附分子的轉(zhuǎn)錄，從而影響單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。為了進(jìn)一步闡明 Lss 敏感 miR-29b-3p/CX3CL1 軸介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞粘附調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，分析了 Lss、miR-29b-3p 和 CX3CL1 對(duì) TNF-α 激活的 HAECs 中 NF-κB 信號(hào)通路的影響。

如圖3 A、B 所示，加載 Lss 后，TNF-α 誘導(dǎo)的 VCAM-1 和 ICAM-1 的上調(diào)受到抑制。此外，Lss 顯著抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的 p65 和 IκBα（也稱為 RELA 和 NFKBIA）磷酸化（圖3 A、B），表明 Lss 可能通過(guò)抑制 NF-κB 信號(hào)通路的激活來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥。

p65 的核轉(zhuǎn)位是激活 NF-κB 信號(hào)的關(guān)鍵。如圖3 C-E 所示，加載 Lss 后，p65 在 TNF-α 激活的 HAECs 細(xì)胞核中的積累顯著減少。此外，免疫熒光分析表明，Lss 顯著降低了 TNF-α 誘導(dǎo)的 p65 核轉(zhuǎn)位（圖3 F）。值得注意的是，miR-29b-3p 敲低逆轉(zhuǎn)了 Lss 對(duì) TNF-α 激活的 HAECs 中 NF-κB 信號(hào)通路的抑制作用。

實(shí)驗(yàn)還探討了 Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 軸是否可以調(diào)節(jié) TNF-α 激活的 HAECs 中的 NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)。如圖3 G、H 所示，miR-29b-3p 的過(guò)表達(dá)顯著抑制了 TNF-α 刺激的 VCAM-1 和 ICAM-1 的上調(diào)，以及 p65 和 IκBα 的磷酸化。在 CX3CL1 敲低的 TNF-α 激活的 HAECs 中獲得了相同的結(jié)果。miR-29b-3p 的過(guò)表達(dá)或 CX3CL1 的敲低減少了 p65 在 TNF-α 激活的 HAECs 的細(xì)胞核中的積累（圖3 I-K）。此外，免疫熒光分析還顯示，過(guò)表達(dá) miR-29b-3p 或敲低 CX3CL1 顯著降低了 TNF-α 誘導(dǎo)的 p65 核轉(zhuǎn)位（圖3 L）。

這表明，Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 軸通過(guò)阻斷 NF-κB 信號(hào)通路減輕內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

圖3 Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 軸通過(guò)阻斷 HAECs 中的 NF-κB 信號(hào)通路來(lái)減輕炎癥反應(yīng)。

為了在體內(nèi)將 Lss 與 miR-29b-3p 和 CX3CL1 聯(lián)系起來(lái)，實(shí)驗(yàn)研究了暴露于湍流（Oss）的ApoE^-/- 小鼠主動(dòng)脈弓內(nèi)膜和暴露于 Lss 的胸降主動(dòng)脈內(nèi)膜中 miR-29b-3p 和 CX3CL1 的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與主動(dòng)脈弓相比，暴露于 Lss 的胸主動(dòng)脈內(nèi)膜中 miR-29b-3p 的表達(dá)上調(diào)，而 CX3CL1 的表達(dá)下調(diào)。此外，體外研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)振蕩剪切應(yīng)力（0.5±4 dyn/cm²）處理的 HAECs 中 CX3CL1 的表達(dá)上調(diào)，而 miR-29b-3p 的表達(dá)下調(diào)。

為了確認(rèn) miR-29b-3p 是否在體內(nèi)調(diào)節(jié) AS 進(jìn)展，給 6 周大的雄性ApoE^-/- 小鼠喂食正常飲食（ND）或高脂飲食（HFD ）4 個(gè)月。隨后檢測(cè) ApoE^-/- 小鼠血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的濃度。結(jié)果表明，與喂食ND的 ApoE^-/- 小鼠相比，喂食 HFD 的 ApoE^-/- 小鼠血清中 HDL-C 濃度顯著降低，而 TG、TC 和 LDL-C 濃度顯著升高。然而，當(dāng) miR-29b-3p 過(guò)表達(dá)時(shí)，HDL-C、TG、TC 和 LDL-C 的濃度恢復(fù)（圖4 C-F）。如圖4 G，與喂食 ND 的 ApoE^-/- 小鼠相比，喂食 HFD 的 ApoE^-/- 小鼠的主動(dòng)脈內(nèi)膜表面不光滑。伴隨著內(nèi)膜增厚和較大的斑塊形成，表明 AS 小鼠模型建立成功。然而，當(dāng)注射 agomir-miRNA-29b-3p 時(shí)，喂食 HFD 的 ApoE^-/- 小鼠的主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊面積顯著減少（圖4 G ）。

這表明，miR-29b-3p 在體內(nèi)改善 AS。

實(shí)驗(yàn)還探討了 miR-29b-3p 是否通過(guò)控制 CX3CL1 的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié) AS 小鼠的內(nèi)膜炎癥，從而影響 AS 的發(fā)生和發(fā)展。蛋白質(zhì)印跡顯示，miR-29b-3p 的過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了喂食 HFD 的ApoE^-/- 小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜中 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 蛋白表達(dá)的增加（圖4 J、K）。此外，免疫組化染色顯示，與喂食 ND 的ApoE^-/- 小鼠相比，喂食 HFD 的 ApoE^-/- 小鼠主動(dòng)脈中 CX3CL1 和 VCAM-1 的表達(dá)顯著增加。然而，miR-29b-3p 的過(guò)表達(dá)下調(diào)了主動(dòng)脈中 CX3CL1 和 VCAM-1 的表達(dá)（圖4 L）。

總之，miR-29b-3p 在體內(nèi)減輕了內(nèi)皮細(xì)胞炎癥，從而改善 AS。

圖4 MiR-29b-3p 在ApoE^-/- 小鼠中減輕 HFD 誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥和 AS 。

總之，在喂食 HFD 的 ApoE^-/- 小鼠中，Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 軸顯著抑制單核細(xì)胞與活化的 HAECs 的粘附并減輕局部炎癥和斑塊形成。因此，它是預(yù)防和治療 AS 的潛在干預(yù)靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Pu L, Meng Q, Li S, Wang Y, Sun B, Liu B, Li F. Laminar shear stress alleviates monocyte adhesion and atherosclerosis development via miR-29b-3p/CX3CL1 axis regulation. J Cell Sci. 2022 Jul 15;135(14):jcs259696. doi: 10.1242/jcs.259696. Epub 2022 Jul 22. PMID: 35735031.

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