牙源性角化囊腫（OKC）是一種局部侵襲性頜部囊性病變，其特點是具有相對較高的生長潛力和復(fù)發(fā)傾向。OKC 的異常行為，沿著頜骨的長軸生長和相對較高的復(fù)發(fā)率，表明其局部侵襲性背后的異常分子事件。血管生成和細胞侵襲是復(fù)雜的多階段過程，始于由蛋白水解酶引起的細胞外基質(zhì)降解，尤其是腫瘤相關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶。

趨化因子是白細胞遷移到炎癥部位的重要遞質(zhì)，在炎癥中起重要作用。在 OKCs 中經(jīng)常檢測到炎癥。先前的研究表明，在 OKC 中，在中度至重度炎癥附近檢測到增殖性上皮細胞的局灶性增加，但對囊腫的整體增殖活性沒有顯著影響。因此，炎癥可能與上皮的局灶性增殖密切相關(guān)。

機械應(yīng)力對肌肉骨骼健康和疾病至關(guān)重要。除遺傳因素外，牙源性囊性病變長期存在囊內(nèi)流體壓力，影響牙源性囊性病變的發(fā)展。機械應(yīng)力現(xiàn)在也可能成為某些形式的慢性炎癥性病變的觸發(fā)因素，例如牙周炎和類風濕性關(guān)節(jié)炎。然而，OKC內(nèi)機械應(yīng)力和趨化因子釋放之間的潛在關(guān)系仍不清楚。

單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）代表了一種發(fā)現(xiàn)健康和疾病中轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性的創(chuàng)新方法，揭示了對組織組成和疾病進展的新見解，實際上，迫切需要發(fā)現(xiàn)有助于 OKC 發(fā)病機制的細胞群。

在口腔生物醫(yī)學教育部重點實驗室（武漢大學）以及武漢大學口腔醫(yī)院口腔頜面外科、口腔修復(fù)科實驗團隊的一項研究中，使用新鮮的 OKC 組織樣本進行單細胞 RNA 測序，旨在定義OKC 的細胞亞群，特別是與血管生成相關(guān)的細胞亞群，并探索血管生成的潛在調(diào)節(jié)機制。結(jié)果表明，CXCLs 在成纖維細胞亞群中高度表達，并與受機械應(yīng)力部分調(diào)節(jié)的內(nèi)皮細胞和骨髓細胞密切相互作用。該研究探討了 OKC 的病理機制，并提供了新的見解。

實驗首先進行單細胞測序和細胞類型鑒定。新鮮的 OKC 組織樣本分為兩部分：一份用于蘇木精伊紅染色，另一份用于 scRNA-seq。對于 scRNA-seq，消化新鮮組織直至獲得含有 1.5×10⁵、1.0×10⁵ 和 1.3×10⁵ 細胞的單細胞懸液，細胞活力分別為 81.60%、83.50% 和 84.3% 。質(zhì)控后得到 14,072 個單細胞，聚類成 8 個細胞群，其中，KRT5+ 基底細胞再次細分成 5 個亞群，成纖維細胞（LUM+）分為 3 個亞群。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OKC 的細胞成分在供體之間表現(xiàn)出高度的異質(zhì)性。

牙源性角化囊組織樣本中的成纖維細胞異質(zhì)性

成纖維細胞（LUM+）聚為三個亞群。SFRP4 和 SPP1 在 fibroblast #1 中高表達（圖1 A）；Fibroblast #3 高表達許多趨化因子的基因，包括 CXCL1、CXCL13、CXCL12、CXCL6 和 CXCL8（圖1 A）；Fibroblast #2 高表達細胞增殖基因，包括 H2AFZ、TOP2A 和 MKI67。分化軌跡顯示，fibroblast #3 分布在發(fā)育的初期（圖2 B）。

根據(jù)分布發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞亞群在病例中有所不同，但 fibroblast #3 占 50% 以上，是常見的類型（圖1 C）。

對 fibroblast #3 的 DEGs 進行 GO 分析，以研究每個亞組的功能。Fibroblast #1 與細胞外基質(zhì)成分和糖胺聚糖結(jié)合有關(guān)（圖1 D）。Fibroblast #2 與微管蛋白結(jié)合和微管結(jié)合有關(guān)（圖1 E）。 Fibroblast #3 在細胞因子活性和趨化因子活性方面表現(xiàn)出富集基因（圖1 F）。這些結(jié)果表明， fibroblast #3 是 OKC 成纖維細胞常見的細胞類型，并且富含趨化因子和細胞因子基因。

圖1 在牙源性角化囊腫（OKC）中鑒定出三種不同的成纖維細胞亞型。（A）從 fibroblasts #1 到fibroblasts #3 的差異基因表達組。（B）3 個OKC 樣本中從fibroblasts #1 分化為fibroblasts #3 的軌跡分析。（C）3 例 OKC 患者中主要成纖維細胞簇的比例。（D-F）對fibroblasts #1到fibroblasts #3中上調(diào)基因進行 GO 分析。

Fibroblast #3 中富含機械應(yīng)力調(diào)節(jié)基因

為了進一步探索成纖維細胞亞群的潛在特征，研究了包括 TAGLN2 和整合素（ITGA8）在內(nèi)的細胞骨架相關(guān)基因，它們在 fibroblast #3 中高表達，表明 fibroblast #3 中潛在的機械調(diào)節(jié)（圖2 A）。

牙源性角化囊腫通常是半流體性病變，檢查過囊內(nèi)流體壓力，初期約為 80 mmHg。為了模擬靜水壓力的潛在影響，實驗采用壓縮加載系統(tǒng)并對成纖維細胞施加 80 mmHg 壓力持續(xù) 6 小時（圖2 B）結(jié)果顯示，與對照組相比，靜水壓力處理的成纖維細胞中 CXCL12 表達明顯上調(diào)（圖2 C）。但其他趨化因子（CCL21、CXCL5、CX3CL1、CXCL1、CXCL8、CCL2、CCL25）無顯著變化（圖2 C）。CXCL5 趨化因子在所有趨化因子中濃度最高（超過 2000 pg/mL）（圖2 C）。

圖2 機械應(yīng)力調(diào)節(jié)成纖維細胞中 CXCL12 的分泌。（A）點圖顯示 TAGLN2 和 ITGA8 在 3 個成纖維細胞簇中的表達。紅色虛線矩形表示 3 個成纖維細胞簇中的平均相對表達 > 0.5。（B）用于對OKC培養(yǎng)的成纖維細胞施加壓力的靜水壓力裝置示意圖。（C）來自靜水壓力（80 mmHg, 6h）處理的 OKC 成纖維細胞上清液的趨化因子譜（CCL21、CXCL5、CX3CL1、CXCL1、CXCL8、CCL2、CXCL12 和 CCL25）。

Fibroblast #3 與 OKC 的血管生成密切相關(guān)

為了進一步評估 CXCLs 的受體，證明了非典型趨化因子受體1（ACKR1）在內(nèi)皮細胞中富集（圖3 A）。使用 CellphoneDB v2.0 研究了細胞-細胞相互作用網(wǎng)絡(luò)。值得注意的是，fibroblast #3 與內(nèi)皮細胞表現(xiàn)出特異性強相互作用（圖3 B）。

為了進一步驗證 CXCLs 的表達水平，構(gòu)建了 OKC 的組織微陣列，免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn) CXCL12 主要在成纖維細胞和免疫細胞中表達（圖3 C）。通過 CXCL12 和 CD31 的 H-score 統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)中 CXCL12 表達與 CD31 的表達密切相關(guān)（圖3 D）。

這些結(jié)果表明，基質(zhì)內(nèi) CXCL12 的表達可能與 OKC 的血管生成密切相關(guān)。

圖3 趨化因子富集的成纖維細胞與內(nèi)皮細胞密切相關(guān)。（A）小提琴圖顯示了主要細胞類型中ACKR1的表達。（B）顯示 CellphoneDB v2.0 預(yù)測的細胞組中潛在配體-受體對數(shù)量的熱圖。（C）OKC組織微陣列中的 CXCL12 和 CD31 染色。（D）OKC 中基質(zhì) CXCL12 與CD31 染色密切相關(guān)。

總之，這項工作是第一項通過 scRNA-seq 在轉(zhuǎn)錄組水平上全面描述 OKC 細胞的研究。研究說明了一種成纖維細胞亞群（稱為富含趨化因子的成纖維細胞）的作用，以及與血管生成和免疫浸潤的密切關(guān)系，后者部分受靜水壓力的調(diào)節(jié)。研究結(jié)果揭示了對 OKC 細胞亞型以及物理微環(huán)境與 OKC 血管生成之間關(guān)系的新見解。因此，有助于理解 OKC 病變內(nèi)的異質(zhì)性，并為 OKC 提供新的發(fā)病機制。

參考文獻：Man QW, Li RF, Li SR, Wang J, Bu LL, Zhao Y, Liu B. Single-Cell RNA Sequencing Reveals CXCLs Enriched Fibroblasts Within Odontogenic Keratocysts. J Inflamm Res. 2021 Dec 24;14:7359-7369. doi: 10.2147/JIR.S342951. PMID: 34992422; PMCID: PMC8713881.

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