人血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）分析檢測ELISA試劑盒使用說明書

    本試劑僅供研究使用

   目的：本試劑盒用于測定小鼠血清，血漿及相關(guān)液體樣本中轉(zhuǎn)化生長因子（TM）的含量。

    實(shí)驗(yàn)原理：

    本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）水平。用純化的轉(zhuǎn)化生長因子（TM）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入轉(zhuǎn)化生長因子（TM），再與HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的轉(zhuǎn)化生長因子（TM）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）濃度。

    試劑盒內(nèi)容及其配制 ：

    試劑盒成份96孔配置48孔配置

    96/48人份酶標(biāo)板1塊板（96T）半塊板（48T）

    塑料膜板蓋1塊半塊

    標(biāo)準(zhǔn)品：100ng/ml  1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）

    空白對照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）

    標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）

    生物素標(biāo)記的抗OT抗體1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）

    親和鏈酶素-HRP1瓶（12ml）1瓶（5ml）

    洗滌緩沖液1瓶（20ml）1瓶（10ml）

    底物A1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）

    底物B1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）

    終止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）

   血栓調(diào)節(jié)蛋白試劑盒 試劑盒組成：

    試劑盒組成48孔配置96孔配置保存

    說明書1份1份

    封板膜2片（48）2片（96）

    密封袋1個1個

    酶標(biāo)包被板1×481×962-8℃保存

    標(biāo)準(zhǔn)品：45μmol/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存

    標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存

    酶標(biāo)試劑3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

    樣品稀釋液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

    顯色劑A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

    顯色劑B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

    終止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

    濃縮洗滌液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存

    自備材料 ：

    1. 蒸餾水。

    2. 加樣器：5ul、10ul 、 50ul 、 100ul 、 200ul 、500ul、1000ul。

    3. 振蕩器及磁力攪拌器等。

    樣品收集、處理及保存方法 ：

    1、血清……操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

    2、 血漿……EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000 ×g離心30分鐘去除顆粒。

    3、 細(xì)胞上清液……1000 ×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

    4、 組織勻漿……將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000 ×g離心10分鐘，取上清液。

    5、 保存……如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

    血栓調(diào)節(jié)蛋白試劑盒操作注意事項(xiàng)：

    ●  試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。

    ●  實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

    ●  不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

    ●  使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

    ●  使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

    ●  底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。

    ●  加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。

    ●  按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

    安全性 ：

    1.  避免直接接觸終止液和底物A、B，一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

    2.  實(shí)難中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

    3.  不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

    試劑的準(zhǔn)備 ：

    1.  標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時準(zhǔn)備，不能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行：

    100

    ng/ml（6號標(biāo)準(zhǔn)品）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul

    50

    ng/ml（5號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

    25

    ng/ml（4號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

    12.5

    ng/ml（3號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

    6.25

    ng/ml（2號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

    3.12

    ng/ml（1號標(biāo)準(zhǔn)品）100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

    0

    ng/ml（空白對照）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul

    2.  洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

    試劑盒性能 ：

    1.  靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

    2.  特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。

    3.  重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

    人血栓調(diào)節(jié)蛋白ELISA檢測試劑盒 操作步驟：

    1.  使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

    2.  根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。

    3.  加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul 于反應(yīng)孔、加入待測樣品 50 ul 于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入 50 ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。

    4.  甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

    5.  每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

    6.  甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

    7.  每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。

    8.  取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。

    9.  在450nm波長處測定各孔的OD值。

    結(jié)果判斷與分析 ：

    1、 儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

    2、 以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（ Y ），相應(yīng)的 OT 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（ X ），做得相應(yīng)的曲線，樣品的 OT 含量可根據(jù)其OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

    3、 檢測值范圍：0-100ng/ml

    4、 敏感度：0.39ng/ml