GPCR (G Protein-Coupled Receptor)，即G蛋白偶聯(lián)受體，在人體內(nèi)分布廣泛，參與眾多生理過程，其功能異常與腫瘤、心臟病、糖尿病、阿爾茨海默癥等重大疾病密切相關(guān)。GPCR 可以通過激活G蛋白（包括 Gαs、Gαi、Gαq 等不同亞型）和β-arrestin蛋白來啟動(dòng)下游信號(hào)通路。目前已上市的GPCR藥物基本都是靶向GPCR結(jié)構(gòu)中的正構(gòu)位點(diǎn)（orthosteric sites），由于GPCR正構(gòu)位點(diǎn)包含高度保守的殘基，相同的正構(gòu)藥物分子可以激活同類型受體，通常會(huì)同時(shí)激活或抑制多種信號(hào)通路，難以實(shí)現(xiàn)精細(xì)調(diào)控。目前，GPCR偏向性別構(gòu)調(diào)控藥物的研發(fā)比例在逐步提高，偏向性別構(gòu)調(diào)控藥物結(jié)合在 GPCR 的別構(gòu)位點(diǎn)上，能夠選擇性地調(diào)節(jié)GPCR信號(hào)通路。

由此可見，由于GPCR的復(fù)雜性和多樣性，在進(jìn)行GPCR藥物高通量篩選時(shí)，需要對(duì)候選藥物進(jìn)行大量的驗(yàn)證和優(yōu)化，以確保其對(duì)于下游信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)控。

瑞孚迪 (Revvity) 基于HTRF和Alpha的均相免洗技術(shù)平臺(tái)，提供G蛋白信號(hào)通路（如cAMP、IP-1等）和 β - arrestin 蛋白信號(hào)通路相關(guān)HTRF& Alpha檢測試劑，讓您快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行GPCR藥物的高通量篩選。

G蛋白信號(hào)通路

GTP Binding HTRF assay

G蛋白是三聚體GTP -結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白的簡稱，由 α、β、γ 三個(gè)亞基組成。在未激活狀態(tài)下，α 亞基結(jié)合 GDP，整個(gè) G 蛋白處于非活性狀態(tài)。當(dāng) GPCR 被激活后，它可以促使 G 蛋白的 α 亞基與 GDP 解離，并與GTP結(jié)合，從而激活下游信號(hào)通路。

瑞孚迪運(yùn)用HTRF原理，對(duì)不可水解的GTP類似物進(jìn)行Eu Cryptate標(biāo)記，同時(shí)對(duì)抗Gαi的單克隆抗體標(biāo)記D2。當(dāng)Gαi和GTP結(jié)合，便會(huì)產(chǎn)生FRET信號(hào)。這個(gè)特定的信號(hào)與Gαi激活態(tài)成正比，原理如圖1所示。

圖1. GTP Binding assay Kit原理

第二信使檢測

當(dāng)GPCR被激活后，GTP結(jié)合的Gα亞基可以調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶（AC）的活性激活下游信號(hào)，Gαs 和Gαi亞型分別激活或抑制腺苷酸環(huán)化酶，將ATP轉(zhuǎn)換成 cAMP；Gαq或Gαo等亞型激活磷酸肌醇磷脂酶 C 酶，將磷脂酰肌醇 4,5 - 雙磷酸酯水解為 DAG 和 IP3，IP3的半衰期很短，其產(chǎn)生后在磷酸酶的作用下生成IP2，然后生成IP1。

瑞孚迪cAMP和IP-1檢測試劑盒均基于競爭法，以HTRF cAMP試劑盒為例，該試劑盒提供Eu標(biāo)記的特異性抗體以及與D2偶聯(lián)的cAMP。能夠直接對(duì)作用于貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞中與Gs/Gi蛋白偶聯(lián)受體的所有類型化合物進(jìn)行鑒定。細(xì)胞產(chǎn)生的cAMP會(huì)與D2標(biāo)記的cAMP競爭，以結(jié)合Eu標(biāo)記的特異性抗體，樣本中cAMP的含量與HTRF成反比，原理如圖2所示。

圖2. cAMP assay Kit原理

β-arrestin信號(hào)通路

β-arrestin主要包括β-arrestin1和β-arrestin2，它在G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）信號(hào)通路的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)配體與 GPCR 結(jié)合并激活 GPCR 后，GPCR會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化。隨后，G 蛋白偶聯(lián)受體激酶（GRK）會(huì)磷酸化激活后的 GPCR 的胞內(nèi)段，磷酸化后的GPCR為β-arrestin提供了結(jié)合位點(diǎn)，從而招募β-arrestin與之結(jié)合。β-arrestin與GPCR結(jié)合后，會(huì)進(jìn)一步發(fā)生構(gòu)象變化。這種變化使得β-arrestin能夠與其他信號(hào)分子相互作用，開啟自身的信號(hào)通路。

β-Arrestin招募實(shí)驗(yàn)通過激活GPCR檢測內(nèi)源性β-arrestin 2和AP2的招募來判斷配體對(duì)β-arrestin信號(hào)通路的影響。瑞孚迪運(yùn)用HTRF原理，對(duì)抗AP2抗體和抗β-Arrestin抗體分別標(biāo)記Eu和D2，當(dāng)AP2和β-Arrestin被招募到受體時(shí)，便會(huì)產(chǎn)生FRET信號(hào)，原理如圖3所示。

圖3. β-arrestin 2 recruitment Kit原理

磷酸化途徑

在GPCR藥物研發(fā)過程中，外源性激動(dòng)劑會(huì)導(dǎo)致GPCR構(gòu)象變化，隨之胞內(nèi)GRK識(shí)別激活受體，細(xì)胞內(nèi)絲氨酸和蘇氨酸發(fā)生磷酸化。此外，第二信使調(diào)節(jié)的激酶也可以參與GPCR磷酸化，包括激酶A和C以及其他絲氨酸/蘇氨酸激酶。磷酸化還會(huì)增加GPCR與β-arrestin的相互作用，從而觸發(fā)第二波信號(hào)傳導(dǎo)。

以瑞孚迪磷酸化ERK（Thr202/Tyr204）為例。該試劑盒使用2種標(biāo)記抗體：一種是帶有供體熒光團(tuán)與蛋白質(zhì)上的磷酸化序列特異性結(jié)合的抗體，另一種是帶有受體熒光基團(tuán)識(shí)別蛋白質(zhì)的抗體。當(dāng)樣本中含有磷酸化蛋白時(shí)，會(huì)拉近供體熒光基團(tuán)和受體熒光基團(tuán)的距離，從而產(chǎn)生FRET信號(hào)。其強(qiáng)度與樣品中存在的磷酸化蛋白質(zhì)的濃度成正比，原理如圖4所示。

圖4.磷酸化蛋白檢測kit原理圖

部分磷酸化蛋白檢測試劑盒列表

GPCR結(jié)合實(shí)驗(yàn)

在藥物研發(fā)的早期階段，通過結(jié)合實(shí)驗(yàn)，可以證實(shí)藥物是否能夠特異性地與目標(biāo)GPCR結(jié)合。結(jié)合實(shí)驗(yàn)還可以通過比較不同藥物與GPCR的結(jié)合親和力，篩選出最有潛力的候選藥物進(jìn)行進(jìn)一步的研發(fā)。

瑞孚迪采用Tag-lite 技術(shù)是將SNAP-Tag與HTRF技術(shù)相結(jié)合，用來進(jìn)行活細(xì)胞表面受體分析，用于研究GPCR和配體的相互作用，原理如圖5所示。

圖5.Tag-lite技術(shù)原理圖

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