摘要本文基于固相微萃取和氣相色譜質(zhì)譜 (SPME-GC/MS) 非靶向測(cè)定蜂蜜中揮發(fā)性組分，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立了不同植物來(lái)源蜂蜜判別和預(yù)測(cè)的方法。利用 SPME-GC/MS對(duì)來(lái)自四種植物來(lái)源（包括洋槐蜜、椴樹(shù)蜜、荊條蜜和油菜蜜）的 87 個(gè)真實(shí)蜂蜜樣品中的全譜揮發(fā)性化合物進(jìn)行非靶向分析。通過(guò)主成分分析 (PCA) 對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)量控制。然后，建立基于偏最小二乘判別分析 (PLS-DA)、樸素貝葉斯 (NB) 和誤差反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (BP-ANN) 的樣品分類預(yù)測(cè)模型。模型的準(zhǔn)確率為 100%，這表明不同植物來(lái)源蜂蜜可以準(zhǔn)確分類。此外，還通過(guò)另外一組獨(dú)立的 20 個(gè)真實(shí)蜂蜜樣品，對(duì)模型的可靠性和實(shí)用性進(jìn)行了驗(yàn)證。所有 20 個(gè)樣品均得到準(zhǔn)確分類。最后，對(duì)椴樹(shù)蜜的特征揮發(fā)性化合物進(jìn)行初步鑒定。這表明，本研究建立的不同植物來(lái)源蜂蜜判別方法是準(zhǔn)確、可靠的，同時(shí)有助于尋找蜂蜜中的特征化合物。

前言蜂蜜以其營(yíng)養(yǎng)和藥用特性成為了受歡迎的天然產(chǎn)物之一。蜂蜜的植物來(lái)源和產(chǎn)地受到消費(fèi)者的日益關(guān)注。蜂蜜的價(jià)格通常與其植物來(lái)源/產(chǎn)地有關(guān)。因此，很有必要開(kāi)發(fā)一種快速?gòu)?qiáng)大的方法來(lái)鑒定不同來(lái)源的蜂蜜。GC/MS 在識(shí)別和定量分析復(fù)雜樣品中的有機(jī)化合物方面具有優(yōu)勢(shì)，與固相微萃取 (SPME) 的組合可用于分析蜂蜜中的揮發(fā)性化合物[1]。本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)介紹了最近發(fā)表的一項(xiàng)關(guān)于非靶向揮發(fā)性化合物圖譜的研究[2]，該研究結(jié)合使用 SPME 和 GC/MS 與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對(duì)中國(guó)蜂蜜的植物來(lái)源進(jìn)行分類。該研究開(kāi)發(fā)出一種基于非特異性揮發(fā)性化合物指紋圖譜和多變量分析分類并預(yù)測(cè)蜂蜜植物來(lái)源的方法。應(yīng)用 SPME-GC/MS在全掃描模式下非靶向采集蜂蜜的全譜揮發(fā)性化合物數(shù)據(jù)。使用各種過(guò)濾參數(shù)進(jìn)行多變量?jī)?yōu)化。然后，建立基于偏最小二乘判別分析 (PLS-DA)、樸素貝葉斯 (NB) 和誤差反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (BP-ANN) 的預(yù)測(cè)模型。最后，對(duì)于具有顯著性差異的化合物進(jìn)行了初步確認(rèn)。

材料與方法蜂蜜樣品87 個(gè)真實(shí)蜂蜜樣品，包括 19 個(gè)洋槐(Robiniapseudoacacia L.) 蜜樣品、22 個(gè)椴樹(shù) (Tilia amurensis Rupr.) 蜜樣品、22 個(gè)荊條 (Vitexnegundo var.heterophyllaRehd.) 蜜樣品和 24 個(gè)油菜(Brassica campestris L.) 蜜樣品，分別采集自中國(guó)北京、吉林、河北和陜西。從養(yǎng)蜂人處直接采集 500 g 以上的各種蜂蜜樣品，并保存在 4 °C 的冰箱中待分析。

化學(xué)品己烷（MS 級(jí)）購(gòu)自 Fisher Scientific（中國(guó)上海）。正己烷購(gòu)自 Sigma-Aldrich，并采用一系列烷烴 (C8H18–C25H52) 計(jì)算保留指數(shù)。利用癸酸甲酯 (Sigma-Aldrich) 作為內(nèi)標(biāo)。實(shí)驗(yàn)用水產(chǎn)自 Milli-Q 水純化系統(tǒng) (Millipore, Bedford, MA, USA)。

固相微萃取使用 CTC 自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)和 2 cm 涂有50/30 µm 二乙烯苯/Carboxen/聚二甲基硅氧烷 (DVB/CAR/PDMS) 的纖維頭（部件號(hào) SU57348U）運(yùn)行 SPME 程序。分析前，將纖維置于氣相色譜進(jìn)樣口中，在 270 °C 下老化 1 小時(shí)。SPME 條件如下：將 3 g 蜂蜜放入包含 1.5 mL 去離子水和 0.5 g 氯化鈉的 20 mL 頂空螺紋口樣品瓶（部件號(hào) 5183-4474）中，并用聚四氟乙烯 (PTFE)/硅橡膠隔墊（部件號(hào) 5183-4477）將樣品瓶密封。然后在 80 °C 下，將涂有 DVB/CAR/PDMS 的纖維頭置于樣品溶液的頂部空氣中暴露 30 分鐘。完成萃取步驟后，將纖維頭從樣品瓶中取出并插入氣相色譜進(jìn)樣口中，在 250 °C 下進(jìn)行 2 分鐘熱脫附。

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析利用 Agilent MassHunter GC/MS 轉(zhuǎn)換軟件 B.07.00 版將 Agilent ChemStation 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為 MassHunter 數(shù)據(jù)。將轉(zhuǎn)換后的GC/MS 數(shù)據(jù)導(dǎo)入 MassHunter 未知物分析軟件（B.07.01 版）中，并根據(jù)未知物分析的優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行解卷積和鑒定。將處理后的蜂蜜樣品輪廓圖導(dǎo)出為 cef 文件，然后導(dǎo)入 Agilent Mass Profiler Professional（13.0 版）中。采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，例如主成分分析(PCA)、單因素方差分析 (ANOVA) 和預(yù)測(cè)模型（包括 PLS-DA、NB 和 BP-ANN）。

結(jié)果與討論數(shù)據(jù)挖掘使用 Agilent MPP 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾和化學(xué)計(jì)量學(xué)分析。對(duì)所有 cef 文件進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾。對(duì)于四組樣品，通過(guò)數(shù)據(jù)匹配總共獲得了 2734 個(gè)化合物。根據(jù) MPP 工作流程，第一個(gè)過(guò)濾器是按標(biāo)記進(jìn)行過(guò)濾，該步驟用于消除不可靠的化合物。根據(jù)各個(gè)樣品是否高于閾值或達(dá)到飽和設(shè)置“存在”和“臨界”標(biāo)志，以從整個(gè)數(shù)據(jù)集中過(guò)濾化合物。保留了 87 個(gè)樣品中至少 2 個(gè)樣品中可接受的化合物。第二個(gè)過(guò)濾器是按頻率過(guò)濾，根據(jù)化合物在樣品中的出現(xiàn)頻率對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾。在該步驟中，必須是存在的化合物才可進(jìn)行該步過(guò)濾。這些過(guò)濾條件保留了每個(gè)樣品中在至少一種條件中出現(xiàn)的化合物。第三個(gè)過(guò)濾器是顯著性分析，根據(jù)單因素方差分析計(jì)算出的 p 值。為確保僅保留存在顯著差異的化合物，在大多數(shù)情況下，選擇的 p 值截止值為 0.05。經(jīng)過(guò)三個(gè)過(guò)濾步驟，將化合物數(shù)量從 2734 減少至 114。為鑒定處理樣品和對(duì)照樣品之間的豐度比或差異超出給定倍數(shù)變化截止值或閾值的化合物，采用倍數(shù)變化分析作為最終過(guò)濾步驟。當(dāng)倍數(shù)變化截止值為 2時(shí)，保留了 110 個(gè)化合物，表明一系列過(guò)濾步驟顯著減少了變量數(shù)量和數(shù)據(jù)集的維數(shù)。