FAK regulates cardiomyocyte mitochondrial fission and function through Drp1

Keywords: Drp1; FAK; fibronectin; mitochondrial fission.

線粒體對(duì)于心肌細(xì)胞的能量產(chǎn)生至關(guān)重要，其功能障礙與心力衰竭的發(fā)展密切相關(guān)。線粒體代謝功能與裂變和融合調(diào)控的線粒體動(dòng)力學(xué)有關(guān)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，線粒體裂變需要?jiǎng)恿Φ鞍紫嚓P(guān)蛋白1（Drp1）。Drp1 是一種由其受體募集到線粒體外膜的 GTP 酶，并參與線粒體膜斷裂。在新生大鼠心室肌細(xì)胞（NRVMs）中，Drp1 的缺失會(huì)累積損傷的線粒體，減少細(xì)胞內(nèi) ATP，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。心肌組織特異性 Drp1 敲除小鼠的心力衰竭表型也證明了 Drp1 在維持正常心臟功能中的作用。

Drp1 對(duì)線粒體裂變功能的調(diào)控涉及各種翻譯后修飾，包括第616位點(diǎn)絲氨酸（S616）的磷酸化，Drp1 S616 的磷酸化促進(jìn) Drp1 的線粒體募集。研究發(fā)現(xiàn)，腎上腺素能受體（AR）激動(dòng)劑增加了 NRVMs 中 Drp1 S616 的磷酸化，誘導(dǎo)線粒體裂變，而Drp1 抑制劑可減少 AR 激活誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。此外，在壓力超負(fù)荷的小鼠心臟中也觀察到 Drp1 S616 磷酸化的增加。然而，Drp1 S616 磷酸化在心肌細(xì)胞中的上游調(diào)控通路和線粒體代謝功能尚不清楚。

基于此，中國(guó)臺(tái)灣省中央研究院生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所的科研團(tuán)隊(duì)在一項(xiàng)研究中探討了參與調(diào)控心肌細(xì)胞 Drp1 磷酸化、線粒體形態(tài)、線粒體代謝功能和能量產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路和細(xì)胞外因子，并最終證明了細(xì)胞外纖連蛋白和腎上腺素刺激通過 FAK-ERK1/2-Drp1 通路來調(diào)控心肌細(xì)胞中的線粒體形態(tài)和功能。研究成果發(fā)表在 The FEBS Journal 期刊題為“FAK regulates cardiomyocyte mitochondrial fission and function through Drp1”。

首先，對(duì) NRVMs 進(jìn)行 6 或 24 h 的循環(huán)拉伸（10%，1 Hz）以評(píng)估 Drp1 介導(dǎo)的線粒體裂變?cè)跈C(jī)械拉伸誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6 h的循環(huán)拉伸導(dǎo)致 NRVMs 中的線粒體呈現(xiàn)更小和更碎片化的形態(tài)，當(dāng)循環(huán)拉伸的持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)至 24 h時(shí)，NRVMs 的細(xì)胞體積顯著增大，線粒體體積減?。▓D1 A-C）。此外，在循環(huán)拉伸前用 Mdivi-1 處理 NRVMs 以抑制 Drp1 介導(dǎo)的線粒體裂變，發(fā)現(xiàn)循環(huán)拉伸24 h后細(xì)胞面積增加，Mdivi-1 預(yù)處理以阻斷 Drp1 活性可降低機(jī)械循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大（圖1 D）。顯性-陰性Drp1（Drp1-K38A）的表達(dá)也抑制了循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的NRVMs 細(xì)胞體積大增大（圖1 E）。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，早期粘著斑激酶（FAK）的激活會(huì)影響拉伸的 NRVMs 的肥大相關(guān)基因的誘導(dǎo)。因此，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了 Drp1 活性對(duì)循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的早期基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn) 6 h 的循環(huán)拉伸增加了 NRVMs 中腦利鈉肽（BNP）和 c-Jun mRNA 的表達(dá)，但Mdivi-1 又降低了 BNP 和 c-Jun 的誘導(dǎo)（圖1 F）。這表明，Drp1 介導(dǎo)的線粒體裂變調(diào)節(jié)機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的 NRVMs 心肌細(xì)胞肥大。

研究人員假設(shè)機(jī)械拉伸通過 FAK 促進(jìn) Drp1 介導(dǎo)的線粒體裂變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未拉伸的對(duì)照組相比，NRVMs 在循環(huán)拉伸6 h后線粒體體積顯著減小。用 Drp1 或 FAK 抑制劑（PF573228）處理 NRVMs，發(fā)現(xiàn)其可阻止循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的線粒體體積減小。這表明Drp1 和 FAK 對(duì)于心肌細(xì)胞中循環(huán)機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的線粒體裂變很重要。進(jìn)一步研究它們?cè)?NRVMs 中的細(xì)胞內(nèi)分布，發(fā)現(xiàn) GFP-FAK 在線粒體外膜上靠近 Drp1，且在 NRVMs 的線粒體部分檢測(cè)到內(nèi)源性 FAK。這些結(jié)果表明，FAK 參與線粒體裂變，并且在空間上接近 NRVMs線粒體中的 Drp1。

Drp1 的磷酸化調(diào)節(jié) Drp1 的線粒體裂變能力。已在壓力超負(fù)荷的小鼠心臟中觀察到 FAK 的早期激活和 Drp1 磷酸化的誘導(dǎo)。因此，實(shí)驗(yàn)假設(shè) FAK 參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞中 Drp1 的磷酸化，通過使用 PF573228 抑制 FAK 活性并測(cè)量 pY397 FAK 和 pS616 Drp1 的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，FAK 抑制劑減弱了 NRVMs 中 FAK 自磷酸化信號(hào)（pY397），且呈劑量和時(shí)間依賴性地降低NRVMs 中Drp1 S616的磷酸化。此外，循環(huán)拉伸增加了 Drp1 S616 的磷酸化，而用 FAK 抑制劑預(yù)處理降低了 NRVMs 中拉伸誘導(dǎo)的 Drp1 S616 磷酸化。通過在循環(huán)拉伸的NRVMs 中表達(dá)Drp1 的顯性陰性 K38A 突變體和在 NIH3T3 細(xì)胞中敲低 FAK，進(jìn)一步確認(rèn)線粒體裂變與FAK 在調(diào)節(jié) Drp1 S616 磷酸化中的作用，證明了FAK 通過影響 Drp1 S616 磷酸化參與調(diào)節(jié) Drp1。

圖1    拉伸誘導(dǎo)的線粒體裂變先于并調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大。

ECM 蛋白纖連蛋白的表達(dá)在肥大性心肌組織中增加。接下來，實(shí)驗(yàn)測(cè)試了纖連蛋白是否可以激活 FAK，然后調(diào)節(jié) NRVMs 中 Drp1 的磷酸化。結(jié)果表明，用纖連蛋白培養(yǎng)的 NRVMs 中 FAK Y397 和 Drp1 S616 的磷酸化增加（圖2 D），因此纖連蛋白可以激活心肌細(xì)胞中的 FAK 和 Drp1 信號(hào)通路。與對(duì)照組相比，含纖連蛋白的 NRVMs 的線粒體中 Drp1 水平增加（圖2 B），且線粒體形態(tài)更加碎片化，體積更?。▓D2 C、D）。這表明，纖連蛋白可以激活 FAK，從而導(dǎo)致 NRVMs 中 Drp1 S616 的磷酸化和線粒體裂變。

先前的研究表明，ERK1/2 通過磷酸化 Drp1 的 S616 位點(diǎn)來調(diào)節(jié)線粒體裂變。因此，實(shí)驗(yàn)測(cè)試了 FAK 是否通過 ERK1/2 調(diào)節(jié) Drp1，發(fā)現(xiàn)用纖連蛋白培養(yǎng)的 NRVMs 中 ERK1/2 的磷酸化（ERK 激活的標(biāo)志）水平增加（圖2 A）。FAK 抑制劑PF573228降低 NRVMs 中 Drp1 S616 和 ERK1/2 的纖連蛋白依賴性磷酸化（圖2 E）。此外，還用 MEK 抑制劑 U0126 處理細(xì)胞，以防止 ERK1/2 的磷酸化和激活，發(fā)現(xiàn)U0126 降低了 Drp1 S616 的磷酸化，但不影響 pFAK Y397，因此在纖連蛋白培養(yǎng)的 NRVMs 中，ERK1/2 激活可能位于 FAK 的下游（圖2 E）。同時(shí)，還表達(dá)并下調(diào)了FAK 和 ERK1/2 抑制劑處理的 NRVMs中的 Drp1-K38A 突變體，發(fā)現(xiàn)Drp1-K38A 突變體的 S616 磷酸化也被 PF573228 和 U0126 抑制（圖2 F）。這些結(jié)果表明，細(xì)胞外纖連蛋白通過 FAK-ERK1/2-Drp1 信號(hào)通路促進(jìn)心肌細(xì)胞線粒體裂變。

然后，通過測(cè)量纖連蛋白培養(yǎng)的 NRVMs 的總 ATP 水平和耗氧率（OCR）進(jìn)一步研究 FAK-ERK1/2-Drp1 信號(hào)通路在線粒體呼吸和能量產(chǎn)生中的作用，結(jié)果表明，FAK-ERK1/2-Drp1 信號(hào)通路參與心肌細(xì)胞能量代謝，抑制該通路會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞能量不足。

圖2 纖連蛋白激活的 FAK 通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）參與小鼠心肌細(xì)胞中 Drp1 介導(dǎo)的線粒體裂變。

心肌細(xì)胞中存在急性線粒體代謝-收縮偶聯(lián)（metabolic?contraction coupling）。AR 激活后，心肌細(xì)胞增加線粒體代謝功能，以匹配收縮力增強(qiáng)的能量需求。之前發(fā)現(xiàn)在膠原蛋白上培養(yǎng)的 NRVMs 在 AR 刺激后具有 Drp1 依賴性耗氧率（OCR）增加。因此，實(shí)驗(yàn)在最后也檢查了 FAK-ERK1/2 是否也在急性 AR 誘導(dǎo)的收縮應(yīng)激下的代謝適應(yīng)中發(fā)揮作用。

用去氧腎上腺素（PE）激活 AR以研究FAK 和 ERK1/2 在明膠培養(yǎng)的 NRVMs 中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PE 增強(qiáng)了明膠表面 NRVMs 的 OCR，抑制 FAK 和 ERK 降低了PE 刺激的 OCR（圖3 A）。用線粒體 ATP 合酶抑制劑寡霉素（Oligomycin）處理后，所有實(shí)驗(yàn)組PE 刺激的 OCR 均逆轉(zhuǎn)到基礎(chǔ)水平，這表明增加的 OCR 用于線粒體 ATP 合成（圖3 A）。然而，在 PF573228 和 U0126 處理的 NRVMs 中，寡霉素-敏感的 OCR 較低 （圖3 B）。這些結(jié)果表明，PE 誘導(dǎo)的 OCR 是由 FAK- 和 ERK1/2- 依賴性通路介導(dǎo)的，以增加心肌細(xì)胞中線粒體 ATP 的合成。

繼續(xù)研究纖連蛋白對(duì) NRVMs 中 AR 誘導(dǎo)的 OCR 的影響。當(dāng) NRVMs在纖連蛋白上培養(yǎng)時(shí)，PE 刺激未能增加 OCR（圖3 C）。研究人員假設(shè) AR 和纖連蛋白使用相同的下游 Drp1 來調(diào)節(jié) NRVMs 的 OCR，一旦纖連蛋白占據(jù)了 Drp1，活化的AR 就無法使用它。因?yàn)槔w連蛋白通過 FAK-ERK1/2-Drp1 信號(hào)通路調(diào)節(jié) NRVMs 的 OCR，所以研究了 AR 激動(dòng)劑刺激后該通路的激活。在明膠培養(yǎng)的 NRVMs 中，PE 增加了ERK1/2 和 Drp1 S616 的磷酸化，PF573228 預(yù)處理可降低PE 誘導(dǎo)的 Drp1 和 ERK1/2 磷酸化，U0126 預(yù)處理可降低 PE 誘導(dǎo)的 Drp1 磷酸化（圖3 D）。然而，在纖連蛋白加明膠培養(yǎng)的 NRVMs 中，PE 未能增加 Drp1 S616 的磷酸化（圖3 E）。這些結(jié)果表明，細(xì)胞外纖連蛋白通過限制 Drp1 的磷酸化來限制腎上腺素能激動(dòng)劑誘導(dǎo)的NRVMs 呼吸。

圖3    FAK、ERK1/2 和 Drp1 參與腎上腺素能激動(dòng)劑對(duì)心肌細(xì)胞呼吸的快速誘導(dǎo)。

總之，這項(xiàng)研究證明了 FAK 通過下游 ERK 激活和 Drp1 磷酸化調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)和功能。通過調(diào)節(jié)線粒體呼吸和 ATP 生物合成，FAK 在各種條件下對(duì)心肌細(xì)胞的能量生成進(jìn)行急性調(diào)控；通過調(diào)節(jié) FAK-ERK1/2-Drp1 通路，心肌細(xì)胞對(duì) ECM 蛋白變化、腎上腺素能激素刺激和機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的壓力進(jìn)行代謝適應(yīng)。該細(xì)胞模型提供了對(duì)心肌細(xì)胞中 Drp1 調(diào)控的分子機(jī)制的見解，并可能解釋心肌肥大的病理結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：Chang YW, Song ZH, Chen CC. FAK regulates cardiomyocyte mitochondrial fission and function through Drp1. FEBS J. 2022 Apr;289(7):1897-1910. doi: 10.1111/febs.16263. Epub 2021 Nov 19. PMID: 34739186.

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