【微載體】

微載體指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細(xì)胞生長的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成，較傳統(tǒng)二維平面基質(zhì)可提供更大的細(xì)胞貼附面積，另外，利用微載體可以實(shí)現(xiàn)貼壁細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)并借助生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)貼壁細(xì)胞的規(guī)?；a(chǎn)，節(jié)省人力、物力和空間。

據(jù)GIR (Global Info Research)調(diào)研，按收入計(jì)，2021年全球微載體收入大約1062.9百萬美元，預(yù)計(jì)2028年達(dá)到1321.3百萬美元，2022至2028期間，年復(fù)合增長率CAGR為 3.2%。調(diào)研預(yù)測顯示微載體的未來需求大規(guī)模擴(kuò)增，但面對市場上琳瑯滿目的載體，我們?nèi)绾芜M(jìn)行選擇呢？

下面我們將從幾個(gè)方面進(jìn)行簡單介紹，幫助大家對微載體細(xì)胞培養(yǎng)有更多了解。

【載體結(jié)構(gòu)與材質(zhì)】

① 結(jié)構(gòu)：

通常分為固體微載體（實(shí)心微載體和多孔微載體）和液體微載體。

圖1：固體微載體的分類及優(yōu)、劣勢分析（點(diǎn)擊查看大圖）

② 材質(zhì)：

微載體的制造材料也是細(xì)胞培養(yǎng)中的?個(gè)關(guān)鍵因素，因?yàn)樗鼘?xì)胞有物理和化學(xué)作?，包括孔隙率、機(jī)械強(qiáng)度、營養(yǎng)物質(zhì)的滲透性、尺?、密度和形狀【2】。

? 人工合成的高分子材料：

例如聚苯乙烯微載體、中空玻璃微載體、聚苯烯酞胺微載體等；

? 天然來源的高分子材料：

例如交聯(lián)明膠微載體、纖維素微載體、殼聚糖微載體、海藻酸、透明質(zhì)酸等；

? 其他無機(jī)材料：

例如玻璃微載體等。

【貼壁依賴的動物細(xì)胞在微載體上貼壁、增殖和收獲】

① 微載體影響細(xì)胞貼附的因素【2】

（1）細(xì)胞與微載體的相融性

細(xì)胞與微載體的相容性主要與微載體基質(zhì)表面的化學(xué)、物理性質(zhì)相關(guān)。一般細(xì)胞在進(jìn)入生理pH值時(shí)，表面帶負(fù)電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細(xì)胞貼壁速度。若微載體帶負(fù)電荷，因靜電斥力使細(xì)胞難于黏附貼壁，但培養(yǎng)液中溶有或微載體表面吸附著二價(jià)陽離子作為媒介時(shí)，則帶負(fù)電荷的細(xì)胞也能貼附。

市場上常見的傳統(tǒng)微載體采用的基本基質(zhì)，如聚苯乙烯、葡聚糖、玻璃等聚合物為電中性的材質(zhì)，無法支持細(xì)胞貼壁，因此通常修飾正電荷或化學(xué)鍵合，以促進(jìn)具有不均勻表?負(fù)電荷分布的貼壁細(xì)胞的附著。?具有較?電荷密度的微載體被開發(fā)?于促進(jìn)弱細(xì)胞系的細(xì)胞粘附（例如 Cytopore 1 和 2）。

? 微載體表面的化學(xué)修飾：

△ 將化學(xué)基團(tuán)結(jié)合到載體表面是一種常見的方法（原理通過改變載體表面電荷的親水性或疏水性）如氨基、伯胺、叔胺和三?胺等基團(tuán)等改變載體表面電性或羧基化、羥基化提高微載體親水性；

△ 引入含相關(guān)細(xì)胞貼附位點(diǎn)的蛋白，如：纖連蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白等。

（2）載體表面物理特征，包括形貌和粗糙度，如多孔或者實(shí)心。

（3）取決于細(xì)胞與微載體接觸的幾率

?載體、細(xì)胞的接種密度；

? 攪拌條件：較低的攪拌速度利于細(xì)胞的接種，而MSC更適合減速接種【2】

② 細(xì)胞在微載體表面的增殖的影響因素

影響細(xì)胞在微載體表面增殖或分化的因素很多，主要有三個(gè)方面。

（1）在細(xì)胞方面：如細(xì)胞群體、活性、狀態(tài)和類型。

（2）在微載體方面：如微載體表面的生化性能、吸附的大分子和離子；微載體表面光滑時(shí)細(xì)胞擴(kuò)展快，表面多孔則擴(kuò)展慢；表面物理特征如剛度和彈性模量、形貌等均會影響細(xì)胞的增殖或分化。文獻(xiàn)報(bào)道剛性表面剛度在34Kpa時(shí)會導(dǎo)致MSCs呈紡錘狀并向骨分化，表面為1Kpa的低剛度則促進(jìn)了軟骨、脂肪、神經(jīng)元分化，而中等表面剛度則促進(jìn)向肌肉分化【2】。

（3）在培養(yǎng)環(huán)境中：如培養(yǎng)基組成、溫度、pH、氧以及代謝廢物等均明顯影響細(xì)胞在微載體上的生長。如果所處條件***，則細(xì)胞生長快；反之生長速度慢。

③ 貼壁依賴的動物細(xì)胞在微載體上的收獲：

容易收獲細(xì)胞或細(xì)胞制品是優(yōu)秀微載體的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，同時(shí)也是用戶選擇載體的關(guān)鍵指標(biāo)之一。

目前市面上常規(guī)的傳統(tǒng)微載體主要采用聚苯?烯、葡聚糖、纖維素或玻璃等不可溫和降解的聚合物作為微載體的基本基質(zhì)。因此在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，較難將細(xì)胞與微載體充分分離成為這些微載體在細(xì)胞收獲過程中需要突破的挑戰(zhàn)【2】。尤其市面上常規(guī)的微載體通過表面修飾增強(qiáng)了電荷，依靠電荷提供較強(qiáng)的細(xì)胞貼壁效果，這使得在細(xì)胞分離時(shí)需要較強(qiáng)的酶消化強(qiáng)度和時(shí)間，而且不能令細(xì)胞消化下來，如此導(dǎo)致較大的細(xì)胞損失和細(xì)胞損傷。

另一方面，不可降解的微載體與細(xì)胞均為固體物質(zhì)，僅靠常規(guī)離心無法分離，需要額外的梯度離心或者過濾的方法將微載體去除以獲得細(xì)胞，增加了整個(gè)生產(chǎn)過程的成本和過程的復(fù)雜性，降低了細(xì)胞回收率和活性。更進(jìn)一步的，所收獲的細(xì)胞用于治療存在安全隱患，因?yàn)槲⑤d體顆粒若無法得到有效去除，其殘留將導(dǎo)致后續(xù)細(xì)胞制品注射體內(nèi)將引起血管堵塞或者異物排斥等安全性問題。

【應(yīng)針對不同應(yīng)用選擇適合的微載體】

綜上不難發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能否在微載體表面附著生長并擴(kuò)展取決于細(xì)胞的特性、微載體理化性質(zhì)、培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件。而微載體性能的優(yōu)良與否是關(guān)鍵的因素，它不僅影響培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)、貼壁率、生長速率、細(xì)胞密度以及是否容易收獲細(xì)胞或其分泌產(chǎn)物，乃至于產(chǎn)物的整個(gè)生產(chǎn)成本。

針對不同的細(xì)胞類型不僅要篩選合適的微載體，也需要合適的接種條件及培養(yǎng)條件，而對于大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)研發(fā)和生產(chǎn)的企業(yè)來說，對各類型微載體的認(rèn)識不是很***，在選擇過程中有很多關(guān)鍵的因素根本考慮不到。

目前華龕生物能夠提供基于不同細(xì)胞在微載體上從接種、培養(yǎng)，到體系放大和收獲等一整套解決方案。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞治療、病毒疫苗、基因工程和組織工程等領(lǐng)域。

【實(shí)例】

① 生物醫(yī)藥領(lǐng)域的微載體應(yīng)用現(xiàn)狀——細(xì)胞治療領(lǐng)域

間充質(zhì)?細(xì)胞的臨床應(yīng)?需要數(shù)?億個(gè)細(xì)胞和?維平臺，這可能對擴(kuò)?規(guī)模構(gòu)成挑戰(zhàn)。

為了在細(xì)胞移植和組織?程應(yīng)?中獲得可 擴(kuò)展的未分化間充質(zhì)?細(xì)胞數(shù)量，與?維培養(yǎng)相?，三維培養(yǎng)技術(shù)是?種更***的?法【2】。

例如：華龕生物利用原創(chuàng)3D TableTrix®W系列多孔可降解微載體、僅針對載體的裂解液結(jié)合自動化生物反應(yīng)器和細(xì)胞收獲裝置可實(shí)現(xiàn)一次1010級別的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑產(chǎn)量。

② 生物醫(yī)藥領(lǐng)域的微載體的應(yīng)用現(xiàn)狀——病毒疫苗領(lǐng)域(vero細(xì)胞)【3】

文中提出已經(jīng)工業(yè)化的微載體技術(shù)為使用 Vero 細(xì)胞系生產(chǎn)病毒提供了一個(gè)強(qiáng)大的平臺，但實(shí)現(xiàn)更高的病毒生產(chǎn)力，該平臺面臨著一些挑戰(zhàn)。與生物工藝相比與其他動物細(xì)胞系相比，Vero 細(xì)胞密度仍然相對較低，一般不超過 107 個(gè)細(xì)胞/mL（圖3）。

文中給出的解決方案：

（1）更深入的研究：分析高細(xì)胞濃度下 Vero 細(xì)胞的狀態(tài)（代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組織學(xué)等方面充分的研究）。

（2）更合適得培養(yǎng)策略：實(shí)時(shí)的營分和待測物濃度檢測，并且及時(shí)的供給及排出【3】。

實(shí)際上，目前華龕已經(jīng)實(shí)現(xiàn)使用3D TableTrix®V系列可高溫滅菌微載體，配合3D FloTrix®vivaSPIN 自動化生物反應(yīng)器，在微載體4g/L~10g/L的條件下，連續(xù)培養(yǎng)一周的時(shí)間即可獲得1×107cells/mL的較高細(xì)胞培養(yǎng)密度。Vero細(xì)胞在微載體上，有較好的貼附能力，該細(xì)胞密度滿足于疫苗的大量生產(chǎn)并且已有相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示其產(chǎn)毒效率亦顯著高于傳統(tǒng)微載體（圖4）。

圖4：使用不同類型微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞產(chǎn)生的某病毒滴度對比

參考文獻(xiàn)

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