外泌體的分離多采用超速離心、磁珠免疫捕獲、沉淀或過(guò)濾幾種方法，這些方法僅適用于前期研究，對(duì)于后期工藝放大難以滿足，限制了規(guī)?；a(chǎn)藥品級(jí)外泌體治療產(chǎn)品供臨床使用。致使有效的外泌體提取和外泌體純化工藝技術(shù)成為外泌體治療市場(chǎng)的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)阻礙。

鑒于外泌體的多種功能和再生潛力，獲得高產(chǎn)量、高純度和高質(zhì)量的外泌體至關(guān)重要。目前，許多外泌體的分離技術(shù)都是基于它們的生物物理和/或生化特征，如大小、密度和特定表面標(biāo)記而開(kāi)發(fā)的。但是，由于要求的不同和生物流體的復(fù)雜性，必須仔細(xì)考慮分離技術(shù)的選擇。

1、 超離心（UC）使用100,000 g的離心力來(lái)有效地分離小顆粒，如病毒、細(xì)菌和細(xì)胞器UC根據(jù)其主要作用機(jī)制大致可分為三類：差速離心(DC)、等密度梯度離心和速率帶離心(RZC)。UC一直被認(rèn)為是外泌體隔離的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。然而，每種生物流體的復(fù)雜性、特定組成和物理性質(zhì)構(gòu)成了獲得可復(fù)制的純外泌體制劑的技術(shù)障礙。

a、差速離心這項(xiàng)技術(shù)依賴于通過(guò)沉降沉淀法對(duì)顆粒進(jìn)行順序分離，這取決于顆粒的大小和密度，通過(guò)使用一系列離心力和持續(xù)時(shí)間。DC通過(guò)300至100,000 g的離心力進(jìn)行多次離心循環(huán)，通過(guò)控制不同的離心力和離心次數(shù)，依次去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片和凋亡小體。最后一次離心(即100,000 g)后，通過(guò)去除上清來(lái)收集外泌體。然而，差速離心法有一些局限性，例如耗時(shí)，需要昂貴的設(shè)備，操作繁瑣，并且在過(guò)高的轉(zhuǎn)速下破壞外泌體的完整性。此外，一些脂蛋白可以與外泌體共沉淀因此，我們提出了密度梯度離心法來(lái)提高外泌體的純度。

b、使用兩種類型的密度梯度超離心：等重超離心和RZC。DC經(jīng)常遭受污染和外泌體損失，因?yàn)橥饷隗w的不均勻性和細(xì)胞外囊泡大小有相當(dāng)大的重疊。UC通常與等滲或RZC技術(shù)相結(jié)合，以允許相對(duì)低密度的外泌體懸浮以進(jìn)一步凈化。該技術(shù)還可以提高外泌體的分離量。典型的密度梯度UC包括以下步驟:首先，將覆蓋樣品顆粒密度范圍的具有不同密度的生物相容性介質(zhì)層(例如，碘二醇或蔗糖)放入管中，從底部到頂部密度逐漸降低。然后將感興趣的樣品添加到密度梯度介質(zhì)的頂部，然后延長(zhǎng)離心時(shí)間(例如，100,000 g離心16小時(shí))。與普通UC相比，密度梯度離心可有效提高外泌體的純度，例如，用密度梯度離心法從豬骨髓中分離骨髓細(xì)胞然而，蔗糖-密度梯度UC分離過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，需要大量的生物樣品，回收率較低。Kuipers等人發(fā)現(xiàn)，對(duì)于小密度梯度的離心過(guò)程，碘沙醇比蔗糖更適合使用，因?yàn)樵诘馍炒继荻戎?，外泌體可以以相對(duì)更快的速度達(dá)到平衡。因此，可以通過(guò)選擇合適的惰性介質(zhì)來(lái)優(yōu)化外泌體的分離，從而提高分離效果。

1. 超濾UF是一種基于物質(zhì)大小的分離方法，利用具有不同分子量截止點(diǎn)(MWCO)的膜分離外泌體，通常與其他方法聯(lián)合使用進(jìn)行進(jìn)一步純化。與UC相比，UF增加了囊泡隔離，顯著縮短了處理時(shí)間，提高了吞吐量，但不需要特殊設(shè)備。但由于剪切力的作用，UF容易發(fā)生開(kāi)裂和變形，造成外泌體的損失。

基于超濾原理，導(dǎo)出了切向流過(guò)濾和順序過(guò)濾方法。在TFF模式下，樣品流體沿平行于膜的方向進(jìn)入，調(diào)節(jié)了膜間壓力，減少了外泌體的損失和膜的堵塞，延長(zhǎng)了膜的使用壽命。TFF在吞吐量、再現(xiàn)性、時(shí)間、成本和可擴(kuò)展性方面都超過(guò)了UC。

2.順序過(guò)濾是另一種常用的方法，其中樣品首先通過(guò)1000 nm的過(guò)濾器去除細(xì)胞碎片和凋亡囊泡，然后通過(guò)500-kD MWCO的第二個(gè)過(guò)濾器去除TFF中的游離蛋白。最后，50 - 200nm直徑的材料可以通過(guò)200nm的過(guò)濾器進(jìn)行隔離。該方法具有溫和、自動(dòng)化、適合大顆粒的優(yōu)點(diǎn)，可用于生產(chǎn)尺寸均勻的外泌體，在很大程度上保證了外泌體的完整性和純度。

為了克服傳統(tǒng)過(guò)濾的局限性，Chernyshev等人開(kāi)發(fā)了不對(duì)稱深度過(guò)濾(DF)，作為一種容易獲得的方法，具有高收率和低外泌體污染。常規(guī)過(guò)濾一般分為表面過(guò)濾和DF過(guò)濾。

在表面過(guò)濾過(guò)程中，大顆粒由于其尺寸而被保留，這些顆粒最終會(huì)在過(guò)濾介質(zhì)表面形成一個(gè)“餅”，而對(duì)于DF介質(zhì)，大空隙允許顆粒進(jìn)入介質(zhì)的孔隙。因此，不對(duì)稱DF方法的原理是，當(dāng)外泌體固定在多孔介質(zhì)表面和深度內(nèi)時(shí)，小顆?？梢员幌疵?。該方法適用于從用于培養(yǎng)ev分泌細(xì)胞的大量培養(yǎng)基中分離治療性外泌體。

TunerSystems外泌體純化系統(tǒng) 是一款研發(fā)型自動(dòng)化過(guò)濾系統(tǒng)，理想的生物工藝開(kāi)發(fā)研發(fā)階段自動(dòng)化切向流過(guò)濾系統(tǒng)，適合處理小體積的料液微濾和超濾，最高可處理量15L，循環(huán)體積可低至10mL。