1、單細胞轉(zhuǎn)錄組建庫方法分類

目前單細胞轉(zhuǎn)錄組的建庫方法基本可以按照技術(shù)方案分為兩類：

1）一類依賴于孔板

通俗的說，就是將已經(jīng)解離的單個細胞分配到孔板中各自的孔中，在孔中單個細胞完成裂解、RNA富集、加細胞條碼( cell barcode )和單分子識別碼(UMI)等步驟后再收集到一起進行測序。

而具體的實施方案會根據(jù)每種建庫方案有一些特色型的變動。目前這一類方法包括CEL-seq、CEL-seq2、SMART-seq、SMART-seq2、Microwell- seq等。

特點:

a.基于孔板的建庫方法總體來說難以達到很高的通量

如SMART-seq2是基于96孔板，那么同批次只能測96個單細胞；microwell-seq通過縮小孔的體積擴大了可以同批量測序的細胞數(shù)目。

b.有基于全長轉(zhuǎn)錄本進行測序的條件

2）另一類依賴于液滴

大致可以理解為通過微流控技術(shù)將單個細胞和一個捕獲RNA的微珠(beads)包裹在液滴中，beads連接的mRNA捕獲oligo上已經(jīng)預(yù)先包含cell barcode和UMI信息，在液滴中完成至少mRNA的富集后再將微珠合并，完成建庫并測序。

具體的實施方案也是隨著不同的方法學(xué)有些許差異。目前這-類方法包括Drop-seq、inDrop、10x genomics等。

特點:

a.基于微流控液滴的單細胞測序建庫的優(yōu)點是可以短時間內(nèi)同批次處理更多細胞(數(shù)千以上)，但由于beads對mRNA的捕獲率所限，這種方法在獲得細胞數(shù)量的突破的同時，可以測到的基因數(shù)減少。

b.這類方法仍主要采用3'末端建庫的方式(只取cDNA的3'末端測序)，所以在基因比對和定量的準確度上有所不及。

3）其他

SPLiT-seq以細胞本身作為“EP管”，將細胞膜穿孔后進行多輪split-pool的原位barcode連接，待每單個細胞內(nèi)的RNA理論上均帶有細胞特異性tag后再pool together。

2、幾種常用的scRNA-seq實驗方法

圖片來源：【豪克博士聊科研】教你單細胞測序（五）操作流程（4） - 知乎

目前常見的單細胞測序方法主要有：Smart-seq2、CEL-seq2、sci-RNA-seq、10x Chromium、Drop-seq、Seq-Well、inDrops。

圖片來源：單細胞轉(zhuǎn)錄組測序簡介-OmicsClass

其中Smart-seq2、CEL-seq2是基于微孔板的方法進行測序，屬于低通量測序。

sci-RNA-seq是基于微孔板組合的方法來隔離細胞并標識細胞，屬于高通量的分析方法。

10x Chromium、Drop-seq、inDrops是基于微流控產(chǎn)生的油包水的方法來隔離細胞，并且是用帶barcode序列的引物微珠來標識細胞的，是高通量的方法。

Seq-Well采用微孔芯片來隔離細胞，再用微珠來標識細胞，屬于高通量方法。

1）Drop-seq

Drop-seq是一種基于使用微流體技術(shù)快速分析數(shù)千個單細胞的方法，Drop-seq測序的原理是利用微流控裝置將帶有條形碼的微珠和細胞一起裝入微液滴，該微液滴相當(dāng)于一個納升大小的反應(yīng)室，可以將單個細胞進行分離，從而單獨進行建庫和測序。

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Drop-seq針對cDNA的3'末端測序。

2）CEL-seq／CEL-seq2

?CEL-seq

CEL-seq通過體外線性擴增（In vitro transcription, IVT）實現(xiàn)單細胞測序。

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a.RT

分離單細胞后，利用含條形碼（barcode）的引物對每管的單細胞進行逆轉(zhuǎn)錄。

該引物含有錨定的ploydT、barcode、5' Illumina測序接頭和一個 T7 promoter。

b.cDNA第二鏈的合成

合成第二條鏈后，形成的就是雙鏈的DNA。

c.體外轉(zhuǎn)錄

將所有的cDNA樣本混合到一起，以達到足以進行體外轉(zhuǎn)錄（In vitro transcription, IVT）的模版量。

T7 promoter用于啟動IVT，以第二條合成的DNA 為模版轉(zhuǎn)錄RNA（所以此時的RNA序列與原 mRNA序列是反向互補的，即antisense RNA，aRNA），此時5'端最外為Illumina 5' adaptor。經(jīng)過多輪 IVT，實現(xiàn)模版的線性擴增。

d.文庫構(gòu)建

擴增好的RNA進一步進行片段化（適合測序的片段長度），同時在RNA的 3' 加接頭(Adaptor)。

進一步對這些RNA進行反轉(zhuǎn)錄為DNA，同時進行 PCR 擴增，擴增后的片段即為建好的庫，然后對這些片段進行paired-end測序。read1記錄barcode信息，read2用于確定mRNA。

?CEL-seq2

CEL-seq2與CEL-seq的不同主要體現(xiàn)在使用了 Fluidigm C1微流體平臺，同時引物增加了 UMI 部分，確保每一個反轉(zhuǎn)錄mRNA被精確的計數(shù)一次。

圖片來源：這么多單細胞測序平臺，我該選哪個？-知乎

相較 CEL-seq，做出了一些改進：

圖片來源：你真的搞懂了單細胞轉(zhuǎn)錄組嗎？-科研這點事兒

a.RT引物中加入了一段6nt的UMI，將8nt的 barcode縮短至6nt，并縮短T7引物和Illumina 5'接頭，使引物總長從92nt縮短至82nt，提升了RT效率。

b.RT時使用SuperScript II，并在第二條鏈合成時使用SuperScript II Double-Stranded cDNA Synthesis Kit。

c.改進了去除 dsDNA和 aRNA的過程，提高產(chǎn)量。

d.IVT得到的RNA在反轉(zhuǎn)錄時，直接插入接頭，不需要進行連接。

3）MARS-seq

MARS-seq的原理與CEL-seq類似，均是通過T7 啟動子連在oligo dT引物上，可以在cDNA合成后啟動IVT。

圖片來源：【豪克博士聊科研】教你單細胞測序（五）操作流程（4） - 知乎

但與CEL-seq不同的是，MARS-seq在單細胞分離時，主要使用的是FACS流式分選，而CEL-seq2/C1單細胞采用細胞稀釋法。

MARS-seq2.0是在MARS-seq基礎(chǔ)上，整合index 分選以及大量平行單細胞RNA測序方法，從而形成的一套流程。MARS-seq2.0引物包含T7啟動子、6bp的barcode 以及8bp的UMI，待單細胞被FACS分選后，進一步將單細胞置入384孔板中。

4）SCRB-seq

SCRB-seq與Smart-seq相似，均是通過PCR的方式對擴增cDNA進行擴增。

但與Smart-seq不同的是，SCRB采用UMI主要對 RNA 3'進行富集，而Smart-seq對mRNA的全長進行分析，兩者還是不一樣的。

SCRB-seq的主要流程：

a.FACS單細胞分選后，加入微孔中；

b.裂解細胞，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，引物含有oligo dT、10bp UMI、6bp barcode以及PCR引物部分；

c.第二鏈的擴增，主要采用PCR的方式進行擴增；

d.進一步對擴增后產(chǎn)物進行PCR指數(shù)擴增；

e.PCR產(chǎn)物片段化并進行3' 端富集；

f.建庫測序。

5）inDrop-seq

inDrop，Drop-seq和10X Genomics使用相似的原理產(chǎn)生微滴，且磁珠引物具有相同的結(jié)構(gòu)，包括PCR柄、細胞條形碼、特異性分子標記（UMI）和poly-T。

?inDrop，Drop-seq和10X Genomics差異點

圖片來源：國人一區(qū)作品：基于微滴的超高通量單細胞RNA-Seq系統(tǒng)的比較分析（IF=14.548）-小桔燈網(wǎng)

a.inDrop系統(tǒng)磁珠引物包含光裂解序列和T7啟動子。

b.磁珠材料：10X和inDrop系統(tǒng)使用的磁珠是水凝膠制成的，Drop-seq使用的是脆性樹脂。

c.10X Genomics磁珠和inDrop磁珠可以固定整個珠子的引物，而Drop-seq磁珠只能在表面攜帶引物。

d.通常，微滴和細胞以低濃度引入，以減少形成雙重態(tài)的機會；也就是說，兩個細胞或兩個珠子被封裝在一個微滴中。包封后，10X Genomics整粒磁珠溶解，將所有的引物釋放到溶液中，提高mRNA的捕獲效率。inDrop通過uv照射，通過裂解來激活引物。Drop-seq使用表面連接的引物來捕獲mRNA分子。

e.反轉(zhuǎn)錄位點：10X Genomics和inDrop是在微滴內(nèi)進行，相反，Drop-seq只捕獲轉(zhuǎn)錄本，沒有進行反轉(zhuǎn)錄。

f.cDNA擴增方式：inDrop使用CEL-seq，而10X Genomics和Drop-seq遵循template-switching，類似于流行的Smart-seq。

g.文庫制備時間：inDrop的微滴外轉(zhuǎn)錄，文庫制備時間延長至24小時以上，而Drop-seq和10X Genomics均可在一天內(nèi)完成。

?inDrop-seq建庫流程

a.在微流設(shè)備中有4個輸入通道，分別是BHMs，細胞，RT/lysis試劑以及油，封裝成微滴；

b.利用UV釋放BHMs上的引物，與裂解細胞得到的 mRNA結(jié)合，進行RT；

c.破壞微滴后將所有cDNA整合，按照CEL-seq protocol進行測序；

圖片來源：文獻解讀 用于研究發(fā)育、生理和疾病的單細胞RNA測序_scRNA-

6）CITE-seq

CITE-seq是利用寡核苷酸標記的抗體，對細胞表面蛋白和轉(zhuǎn)錄組同時進行測定的技術(shù)。

單細胞測序的部分和10X的原理是一樣的，只是CITE-seq在原有單細胞測序的基礎(chǔ)上加了抗體，抗體可以結(jié)合到細胞表面相應(yīng)的蛋白上，抗體上帶有特殊的DNA標簽。

?CITE-seq建庫流程

a.設(shè)計DNA-barcoded antibodies

通過鏈霉親和素-生物素互作，將寡核苷酸5'端與抗體相連，而這種通過二硫鍵的結(jié)合會在還原條件下斷裂，釋放寡核苷酸。

圖片來源：CITE-seq：同時測細胞表面蛋白和RNA的單細胞測序

寡核苷酸中包括用于PCR擴增的handle，用于抗體身份識別的barcode，以及能與oligo-dT引物結(jié)合的一段polyA序列。

b.液滴生成

將antibody-oligo復(fù)合物與單細胞懸液共孵育（條件設(shè)置參照流式細胞染色），抗體和細胞結(jié)合后洗去未結(jié)合的抗體，隨后樣本即可對接10x技術(shù)被分成油包水小液滴。

c.細胞裂解和逆轉(zhuǎn)錄

細胞裂解，使得帶有oligo-dT的beads與細胞 mRNA及抗體-寡核苷酸復(fù)合物3'端的polyA尾巴結(jié)合，然后對同一細胞的mRNA和寡核苷酸進行RT 和PCR，并標記上相同的cell barcode。

擴增了的來源于抗體的序列(ADTs)和cDNA分子能夠通過大小區(qū)分開，從而分別進行Illumina測序文庫的制備。

由于兩種文庫可以獨立生成，因此可以調(diào)整其在單個lane中的比例以確保各自所需的測序深度。

?CITE-seq的優(yōu)點

a.同時測mRNA+蛋白信息，數(shù)據(jù)更豐富，對細胞的注釋更準確，有助于發(fā)現(xiàn)新的細胞類型。

b.由于barcode的存在，CITE-seq檢出的mRNA+蛋白是可以對應(yīng)的，也就是說是可以同時得到每個細胞的mRNA+蛋白表達量。

c.與流式細胞相比，CITE-seq又可以不受抗體之間信號干擾的影響，大大增加了表面蛋白標記的數(shù)量(一次可以檢出多達100個的蛋白)，從而可以一次性獲得多種由抗體蛋白指示的免疫表型的信息。甚至，如果關(guān)注點在細胞蛋白上，ADTs可以獨立于細胞的mRNA而單獨測序、分析。

d.CITE-seq能夠與10X Genomics無縫銜接，方便易操作。

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