近年來有研究發(fā)現(xiàn)，納米顆粒的粗糙度對其性質和功能有顯著的影響，清晰的理解表面粗糙度對外部刺激的反應和相互作用，可以為預測納米顆粒在遞送、分布等現(xiàn)象中的行為提供可靠信息。因此獲得表面粗糙度信息對材料性能的研究具有重要的意義。目前，常通過光學顯微鏡和原子力顯微鏡測量這種特性，但光學顯微鏡僅能在毫米尺度上定位納米顆粒的突起處，AFM對表面不平整樣品的定位非常有挑戰(zhàn)性。

美國Quantum Design公司推出的AFM/SEM二合一顯微鏡FusionScope，將SEM、AFM以及EDS等多種技術深度融合，通過共享坐標系，可提供AFM-SEM-EDS三位一體的原位相關解決方案，輕松揭示來自同一目標區(qū)域的不同特性。其中樣品臺可以實現(xiàn)-10°-80°旋轉，為探針提供側向視野，可視化記錄探針在樣品表面掃描的動態(tài)過程，排除一切不確定因素，為測試結果提供最直接的證據(jù)。

基于此，美國Quantum Design公司利用AFM/SEM二合一顯微鏡FusionScope對表面形貌極為復雜的維生素C顆粒進行了多維度、全面的研究。首先，借助FusionScope的SEM識別特定單個顆粒的能力，將懸臂尖精確引導至目標區(qū)域，同時利用側向視野觀察AFM的實時動態(tài)測量過程，最后結合SEM成像、AFM形貌測量以及力-距離曲線分析，獲取了單個顆粒的形態(tài)、表面粗糙度信息以及探針尖被顆粒污染的可能性，為增強顆粒研究和分析方法奠定了基礎。

本實驗中，研究者采用3.5kV低加速電壓，以消除SEM在掃描維生素C有機顆粒時產生的電荷積累。FusionScope的SEM功能可以輕松識別和定位目標維生素C顆粒（圖1a），可視化提供懸臂尖運動的實時狀態(tài)，自動將AFM尖精準導航至目標區(qū)域，側向視野可以直觀的觀察懸臂尖，確保尖處于顆粒的預期位置（圖1b）。隨后，在調幅模式下進行高分辨率AFM成像（圖1c）。觀測所得的SEM和AFM數(shù)據(jù)都可以在FusionScope軟件中相關聯(lián)，使數(shù)據(jù)分析變得簡單明了（圖1d）。

圖1：通過FusionScope獲得SEM與AFM疊加圖像的流程，(a)分辨目標維生素C顆粒；（b）通過側向視野AFM探針置于目標顆粒上方；（c）掃描得到顆粒的高分辨AFM圖像；(d)將兩個通道疊加。

為了對維生素c顆粒進行全表征，本工作中重點分析了3種不同形狀和大小的顆粒，以評估它們的表面粗糙程度。圖2中顯示了3個單獨顆粒的SEM正視圖，可以清晰分辨三組樣品的大小和結構。

圖2：SEM 頂部視野中的三種不同形貌的維生素C顆粒。

利用FusionScope的共享坐標系，研究者將AFM尖無縫導航到每個獨立的顆粒表面。樣品和探針尖的近正交視角進一步促進了精確定位，特別是接近具有精細結構的樣品時，如顆粒3。

圖3：SEM側向視野中探針尖靠近3組樣品表面。

圖4：振幅模式下記錄的AFM形貌掃描圖，3組顆粒的結果顯示如圖，藍色框中顯示的是粗糙度測量范圍，粗糙度的結果從~600 nm（顆粒1），到420 nm（顆粒2），再到150 nm（顆粒3）不等。

圖5：(Top)高分辨的AFM形貌和相位圖像顯示出顆粒2的可能組成成分。（Middle）AFM形貌與相圖的疊加圖案揭示在同一個結構處二者具有不同的成分（Bottom）在ROS1和ROS2兩處的力曲線揭示材料具有不同的剛度和粘附性能。

該樣品所有的力-距離曲線測試包括當懸臂梁接近樣品表面（圖6（1））至與樣品接觸（2），到懸臂梁將顆粒向下推到底部（3），最后對顆粒進行真正的機械力探測，都是用SEM 在側向視野中觀察到的。紅色曲線表示的探針偏折其實是一種假象，將力-距離測量與SEM側向視野相結合，能夠避免這些誤導性的結果，并提供微小物體表面的力學性能的分析。

側向視野中觀察到的傾斜樣品力學曲線測量動態(tài)過程

圖6：SEM圖像顯示了在獲取力-距離曲線時懸臂梁的位置，為了說明納米顆粒在力-距離曲線中的運動，在SEM 圖像中添加了水平虛線后，將其分成了三個階段并獲得力曲線（a-c）。圖6（1）和圖6（2）之間的力-距離曲線顯示懸臂在接觸顆粒之前的恒定偏折；另一方面，在圖6（2）-（3）之間顯示了偏折量的增加，該變化是由于探針將顆粒向下推到了表面；最后綠色曲線所示陡峭的力增長是由于納米顆粒定格至底部，完整的力曲線如圖6d所示。