前言

HCP ELISA檢測方法必須要通過法規(guī)認可的實驗方法（ICH或FDA指南等）進行方法學驗證，以確保其能夠產生準確的結果。想要獲得準確的HCP ELISA檢測結果，本質上是要保證樣品中HCP的濃度高于試劑盒的定量下限（LOQ），同時HCP的檢測抗體還要處于過剩狀態(tài)，滿足這兩點就必須要對檢測樣品（過程樣品和最終的藥物原液）進行稀釋線性驗證。因此，稀釋線性（dilution linearity）是驗證HCP ELISA方法特異性和準確性的關鍵實驗之一。在HCP檢測中，稀釋線性不佳的原因主要有兩種：一種是樣品中某些HCPs的抗體過剩條件不滿足，需要通過進一步稀釋來達到“最小必要稀釋倍數”（MRD）；另一種是產品蛋白本身或產品配方緩沖液中的某些成分對HCP的檢測產生干擾，可以采用指定的樣品稀釋液（見文末）或者緩沖液置換等方式處理樣品來滿足檢測需求。關于樣品稀釋液，最優(yōu)的選擇是使用和標準品相同的稀釋液。Cygnus針對每種ELISA檢測方法都提供了相應的樣品稀釋液，以確保檢測結果的準確性和可重復性。對于使用Cygnus HCP ELISA試劑盒的用戶，我們建議將可接受的稀釋線性定義為“在兩倍稀釋時，校正后的HCP濃度變化不超過±20%”。同時，還要避免檢測值靠近定量下限，即稀釋樣品HCP檢測值不能低于定量下限的兩倍。接下來，本文將為您詳細解讀HCP ELISA方法學驗證中有關線性稀釋的操作方法與注意事項。

為什么要建立稀釋線性？

在測試一個新的宿主細胞蛋白（HCP）ELISA方法時，建立稀釋線性是第一項基礎實驗，目的是確認所選擇的HCP ELISA是否適用于您的過程樣品和藥物原液中的HCPs。當稀釋線性確認后，它將為進一步的分析驗證提供所需的實驗條件信息，因此稀釋線性通常是最先進行的驗證實驗。

具體來講，稀釋線性實驗的目的是確定ELISA方法對樣品中HCPs的反應曲線和全定量范圍。成功驗證了稀釋線性意味著對存在于該樣品中的各種HCPs，抗體過剩條件已滿足，且樣品基質不會影響HCP的定量，從而保證HCP ELISA檢測結果的可靠性。

如何進行稀釋線性實驗？

在進行ELISA分析之前，任何可能超過定量上限（ULOQ）的樣品都應該先進行稀釋線性實驗。其過程包括：用驗證過的樣品稀釋液對HCP待檢樣品進行多個梯度稀釋，然后對這些稀釋樣品進行檢測，并計算每個稀釋樣品中校正后的HCP濃度（即測得的HCP濃度×稀釋倍數）。大多數情況下，在達到一定稀釋倍數后，稀釋樣品校正后的HCP濃度值會出現(xiàn)相對恒定狀態(tài)，那么該稀釋倍數則被稱為“最低需求稀釋度”（MRD）。

圖1 最低需求稀釋度（MRD）

如下表案例，樣品在高濃度（未稀釋和1:2，1:4稀釋）時并未顯示出良好的稀釋線性，但隨著進一步稀釋，我們可以確定一個MRD，即在此稀釋度實現(xiàn)了可接受的稀釋線性（見下表藍色行）。按照定義，當校正后的HCP濃度在2倍稀釋之間的變化范圍不超過±20%時，即達到了可接受的稀釋線性，同時還要避免靠近定量下限，即稀釋樣品HCP檢測值不能低于定量下限的兩倍（在這個案例中1:64稀釋樣品HCP檢測值＜2倍LOQ，因此未計入統(tǒng)計）。變化百分比可以通過減去前一稀釋樣品濃度的校正值，然后將差值再除以前一個稀釋樣品濃度的校正值來計算。例如，1:2稀釋樣品相較未稀釋樣品的變化百分比為：[(233-146)/146]x100%=60%。

從表中數據我們可以得出結論，該樣品的MRD為1:4，那么最終計算出HCP的濃度應在MRD以下（或等于）和LOQ以上所有校正后HCP濃度的平均值（在此例中，應取312、361、356和370的平均值即350ng/mL）。

在實際應用中，我們應當對需要檢測HCP的所有樣品類型（包括過程樣品以及最終的藥物原液）進行稀釋線性的評估，并將每種樣品類型和基質的MRD值以及稀釋不同樣品的具體指導納入到SOP文件中。

稀釋線性不佳的原因與解決方法

對于HCP ELISA檢測，可能會出現(xiàn)某些HCPs稀釋線性不佳的情況，也就是樣品中存在某些HCPs的抗體過剩條件未被滿足。例如，個別高濃度的HCP可能對該特定HCP的抗體產生飽和，出現(xiàn)了“鉤子效應（high-dose hook effect）”，從而導致該HCP的定量不準確。

圖2 鉤子效應（high-dose hook effect）示意圖

此外，某些伴隨蛋白（hitchhiker proteins）可能會與產物蛋白相互作用，并在純化過程中顯著富集，從而完全干擾整個分析的線性。

圖3. 伴隨蛋白（hitchhiker proteins）與產物蛋白相互作用干擾分析線性

其他導致稀釋線性不佳的原因還有可能是產品配方（或過程樣品的緩沖溶液）中的某些成分干擾了檢測，對于Cygnus HCP ELISA試劑盒，已知的干擾因素包括極端pH、洗滌劑、有機溶劑、高蛋白濃度和高鹽濃度等，因此我們建議樣品的稀釋一定要使用和標準品相同的稀釋液，詳見下表。

Cygnus不同生物工藝雜質檢測試劑盒對應的樣品稀釋液一覽

最后，我們再次強調，只有在抗體過剩的情況下，劑量反應曲線才會呈正斜率，檢測結果才是準確的。

如果稀釋線性不佳的因素是由HCP抗體不足或樣品基質干擾，那么隨著樣品的稀釋倍數增加，其測得的HCP濃度會呈現(xiàn)上升趨勢，因此需要通過進一步稀釋樣品來達到MRD。如果是其他原因，也可以通過優(yōu)化實驗步驟來提高檢測的準確性。如果增加樣品的稀釋倍數仍無法解決稀釋線性不佳的問題，則有可能是純化過程存在問題。

Cygnus針對每一種檢測試劑盒均提供相應的QS（Qualification Summary）文件，如有需求歡迎點擊這里填寫信息索取，或者聯(lián)系Cygnus中國總代理西美杰。如果您在Cygnus HCP ELISA試劑盒的使用中遇到了稀釋線性相關問題且無法通過上述方法解決的，也歡迎您隨時聯(lián)系西美杰，我們的技術支持會針對您的問題提供相應解決方法和建議。接下來我們還會陸續(xù)分享一系列關于HCP ELISA方法學驗證的內容，包括加標回收以及HCP抗體適用性驗證等，敬請關注。

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