瑞士oligo DNA核酸快速脫保護基反應(yīng)器——DNA氨解儀是為有效制備生物樣品而設(shè)計的，用于PCR引物、探針和組分生產(chǎn)，DNA測序、DNA和RNA合成、隨機啟動、載體設(shè)計、DNA指紋和人工基因合成。是DNA/RNA/寡核苷酸脫保護基快捷穩(wěn)定的解決方案。反應(yīng)可直接在96位樣品架上進行，如“深井”板。6-10個樣品架可用于10升壓力反應(yīng)器。因此，操作工作量大大縮短。樣品被填充不同的板，例如帶有過濾底座、特殊蓋等，通過設(shè)計的電動升降系統(tǒng)，在反應(yīng)中和反應(yīng)后自動移出壓力容器進行干燥。在開啟和關(guān)閉過程中，會抽走腐蝕性反應(yīng)氣體，確保實驗室人員的*安全。與樣品的反應(yīng)發(fā)生在氣相的壓力和微波效應(yīng)下。高氣相濃度會在幾分鐘內(nèi)引起*均勻的反應(yīng)。在系統(tǒng)中，所有操作參數(shù)均一直根據(jù)程序條件進行控制，并以圖形方式記錄和存儲以進行質(zhì)量控制。在整個過程中，液體試劑以及氣相中的壓力和溫度是被控制的。這確保了樣品的完整、可重復(fù)和均勻反應(yīng)，以便隨后分離出選擇性DNA序列。*的10升反應(yīng)器容量為*的樣品吞吐量提供了新的可能性。

 

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護基反應(yīng)器——DNA氨解儀應(yīng)用：

食品工業(yè)

研究機構(gòu)

大學(xué)

分子生物學(xué)

遺傳學(xué)

合成生物學(xué)

醫(yī)學(xué)

 

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護基反應(yīng)器——DNA氨解儀特點：

反應(yīng)器容量：10升容量

樣品數(shù)量：6至10個，每個樣品有96位。

溫度范圍:*200°C

功率輸出：1200瓦

符合CE標志

保修12個月

電源：220 V至240 V/50/60 Hz

*功耗：2500瓦

顯示屏：彩色觸摸屏

尺寸:W x D x H 52 x 73 x 123厘米（無終端）

重量：180公斤

 

DNA化學(xué)合成固有的錯誤率較高，片段越長越是如此，挑選序列正確的克隆所花費的時間和金錢比DNA合成要多去了。挑克隆著實花費了無數(shù)學(xué)生們的不少好時光。所以，大家的選擇標準也從價格漸漸回歸到質(zhì)量。各廠家之間，從過去拼價格，拼速度，到如今，拼的是純化質(zhì)量了。

說起DNA合成，幾位前輩師兄師姐們猶會提起上世紀90年代世行dai款買儀器，好些單位甚至醫(yī)院都趕時髦買了DNA合成儀，買回來才發(fā)現(xiàn)自己那點合成需求和費用，委實買得起用不起，那昂貴的設(shè)備成了擺設(shè)。彼時國外DNA合成雖然質(zhì)量好純度高，可寄回來海關(guān)不好過，時間上實在傷不起，幸虧國內(nèi)迅速崛起的幾家DNA定制合成供應(yīng)商，以到貨速度快和價格優(yōu)勢漸漸占據(jù)了低端市場，對于實驗室來說，DNA定制合成于是變成了發(fā)傳真+等收貨那么簡單的事。

也沒那么簡單。DNA化學(xué)合成固有的錯誤率較高，片段越長越是如此，挑選序列正確的克隆所花費的時間和金錢比DNA合成要多去了。挑克隆著實花費了無數(shù)學(xué)生們的不少好時光。所以，大家的選擇標準也從價格漸漸回歸到質(zhì)量。各廠家之間，從過去拼價格，拼速度，到如今，拼的是純化質(zhì)量了。不純化，PAGE純化，HPLC純化，到反相純化，有多大區(qū)別？純化過的DNA oligo是不就去除了全部錯誤序列呢？我們得先從DNA合成的錯誤成因談起：

1. 內(nèi)部缺失（n-1，n-2 etc）產(chǎn)物。這是化學(xué)合成DNA zui普遍與zui主要的限制因素，且不能通過純化DNA oligo來解決這個問題?；瘜W(xué)合成DNA不及活細胞內(nèi)DNA復(fù)制具有高保真性，在活細胞內(nèi)，存在大量的校正與修復(fù)系統(tǒng)，將堿基突變率降低至1/(1×106)以下。PCR反應(yīng)也具有較高的保真度，例如：錯誤率在1/1000——1/10000，并且還可通過DNA 聚合酶的性能提高保真度。但是化學(xué)合成DNA不同，每單個合成循環(huán)的錯誤率約為1/100，隨堿基數(shù)目增加而增加。其原因包括：

(1)DNA oligo的化學(xué)合成是堿基與堿基之間通過化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)而成，而化學(xué)反應(yīng)的偶聯(lián)效率一般在99%左右，也就是說，在每次進行偶聯(lián)反應(yīng)時，都會有1%的DNA片段附加不上新的堿基，對這種截斷的失敗序列，為了防止其參與后續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)，采用CapA與CapB進行化學(xué)封閉，以阻斷其延伸，但化學(xué)封閉反應(yīng)的效率不可能達到100%。導(dǎo)致出現(xiàn)合成失敗的DNA片段或截斷序列殘留在合成的DNA粗制品中。

(2)DNA oligo的不*脫保護。寡核苷酸的*脫保護包括從磷酸酯基團、堿基上的環(huán)外氨基和5′-OH部分上去掉保護基團。脫保護的化學(xué)反應(yīng)效率不可能達到100%，未脫保護的堿基無法參加偶聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致DNA oligo內(nèi)部缺失堿基。

(3)不斷延長的DNA鏈與不斷累積的副產(chǎn)物會干擾DNA oligo的化學(xué)合成。

對于以上三方面問題，至今為止還沒有找到一個的解決方案。因為延長蓋帽時間也不能保證封閉反應(yīng)效率達到100%；而對于脫保護反應(yīng)來說，增加脫保護試劑量及延長脫保護時間又會導(dǎo)致DNA oligo脫嘌呤。因此只能采取折衷方法將不*脫保護與脫嘌呤同時控制在低水平上。內(nèi)部缺失堿基的截斷序列絕不可能100%去除干凈，對于幾種純化方法來說，OPC或HPLC不可能去除內(nèi)部缺失堿基的截斷序列，的方法是通過PAGE純化降低截斷序列數(shù)量。

2.　單核苷酸的插入是存在于目的DNA oligo產(chǎn)物中的另一種常見的序列錯誤。

當同一DNA oligo分子中存在G-偶聯(lián)或單堿基插入(n+1)同時又存在單堿基缺失（n-1）時，此條DNA oligo的長度與目的DNA分子的長度相同，因此無法通過OPC 、HPLC或PAGE純化將此“失敗序列”去除。 DNA oligo化學(xué)合成存在的這些弊端曾被Hecker KH與Rill R報道過（Error analysis of chemically synthesized polynucleotides.　Biotechniques，1998 Feb；24：256-260）。在這篇文章中，作者合成并PAGE純化了長鏈DNA oligo，用它們進行PCR克隆，然后測序鑒定了10個克隆，發(fā)現(xiàn)存在7個單堿基缺失，一個連續(xù)的4個堿基缺失，一個G-C替換。除了這些堿基錯誤，其它學(xué)者還曾報道存在G-偶聯(lián)、分支及其n+x產(chǎn)物。

為了解決上述堿基出錯的問題，首先要優(yōu)化化學(xué)合成方法來提高DNA oligo的純度，并且對DNA oligo粗制品進行純化，雖然無論哪種純化方式都不能保證去除錯誤序列，但能改善產(chǎn)品的純度，進而提高實驗的成功率。Oligo的純化方式常見的有脫鹽、OPC、PAGE和HPLC。脫鹽只能去除氨、鹽等雜質(zhì)，而不能有效去除合成過程中產(chǎn)生的短片段，因此一般只能用于普通的PCR反應(yīng)和測序。HPLC和PAGE純化得到的純度很高，但只能進行手工操作，相當費時費力。OPC不僅能去除短片段，當DNA oligo的長度在40 bases以內(nèi)，其純度與HPLC或PAGE純化的純度相當，而且由于簡便、快捷，能進行高通量（high-throughput）和自動化（automation）操作，因而受到很多DNA合成公司的青睞。

但OPC純化也有一個缺點，就是在操作過程中需要一種弱酸脫掉DMT基團，而DNA Oligo在酸性條件下容易脫嘌呤（depurination）。對于脫嘌呤后的堿基，DNA聚合酶不能識別，可能導(dǎo)致PCR擴增后出現(xiàn)堿基缺失或錯配。因此，有些公司不推薦OPC純化用于克隆、突變、基因合成等實驗。

一般來說，不同廠家的合成方法其實并沒有什么大的本質(zhì)的區(qū)別，只是有一些經(jīng)驗的積累和技巧。比如脫保護劑濃度的選擇很重要，太低脫保護不*，太高又增加脫嘌呤的機率，還有如何優(yōu)化程序，使蓋帽更充分、更*等等…。純化方式的選擇，一般說來修飾標記要用HPLC純化，長鏈要用PAGE 純化，但這兩種純化方式都非常費時耗力。

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護基反應(yīng)器——DNA氨解儀是為有效制備生物樣品而設(shè)計的，用于PCR引物、探針和組分生產(chǎn)，DNA測序、DNA和RNA合成、隨機啟動、載體設(shè)計、DNA指紋和人工基因合成。是DNA/RNA/寡核苷酸脫保護基快捷穩(wěn)定的解決方案。反應(yīng)可直接在96位樣品架上進行，如“深井”板。6-10個樣品架可用于10升壓力反應(yīng)器。因此，操作工作量大大縮短。樣品被填充不同的板，例如帶有過濾底座、特殊蓋等，通過設(shè)計的電動升降系統(tǒng)，在反應(yīng)中和反應(yīng)后自動移出壓力容器進行干燥。在開啟和關(guān)閉過程中，會抽走腐蝕性反應(yīng)氣體，確保實驗室人員的*安全。與樣品的反應(yīng)發(fā)生在氣相的壓力和微波效應(yīng)下。高氣相濃度會在幾分鐘內(nèi)引起*均勻的反應(yīng)。在系統(tǒng)中，所有操作參數(shù)均一直根據(jù)程序條件進行控制，并以圖形方式記錄和存儲以進行質(zhì)量控制。在整個過程中，液體試劑以及氣相中的壓力和溫度是被控制的。這確保了樣品的完整、可重復(fù)和均勻反應(yīng)，以便隨后分離出選擇性DNA序列。*的10升反應(yīng)器容量為*的樣品吞吐量提供了新的可能性。

 

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護基反應(yīng)器——DNA氨解儀應(yīng)用：

食品工業(yè)

研究機構(gòu)

大學(xué)

分子生物學(xué)

遺傳學(xué)

合成生物學(xué)

醫(yī)學(xué)

 

瑞士oligo DNA核酸快速脫保護基反應(yīng)器——DNA氨解儀特點：

反應(yīng)器容量：10升容量

樣品數(shù)量：6至10個，每個樣品有96位。

溫度范圍:*200°C

功率輸出：1200瓦

符合CE標志

保修12個月

電源：220 V至240 V/50/60 Hz

*功耗：2500瓦

顯示屏：彩色觸摸屏

尺寸:W x D x H 52 x 73 x 123厘米（無終端）

重量：180公斤

 

DNA化學(xué)合成固有的錯誤率較高，片段越長越是如此，挑選序列正確的克隆所花費的時間和金錢比DNA合成要多去了。挑克隆著實花費了無數(shù)學(xué)生們的不少好時光。所以，大家的選擇標準也從價格漸漸回歸到質(zhì)量。各廠家之間，從過去拼價格，拼速度，到如今，拼的是純化質(zhì)量了。

說起DNA合成，幾位前輩師兄師姐們猶會提起上世紀90年代世行dai款買儀器，好些單位甚至醫(yī)院都趕時髦買了DNA合成儀，買回來才發(fā)現(xiàn)自己那點合成需求和費用，委實買得起用不起，那昂貴的設(shè)備成了擺設(shè)。彼時國外DNA合成雖然質(zhì)量好純度高，可寄回來海關(guān)不好過，時間上實在傷不起，幸虧國內(nèi)迅速崛起的幾家DNA定制合成供應(yīng)商，以到貨速度快和價格優(yōu)勢漸漸占據(jù)了低端市場，對于實驗室來說，DNA定制合成于是變成了發(fā)傳真+等收貨那么簡單的事。

也沒那么簡單。DNA化學(xué)合成固有的錯誤率較高，片段越長越是如此，挑選序列正確的克隆所花費的時間和金錢比DNA合成要多去了。挑克隆著實花費了無數(shù)學(xué)生們的不少好時光。所以，大家的選擇標準也從價格漸漸回歸到質(zhì)量。各廠家之間，從過去拼價格，拼速度，到如今，拼的是純化質(zhì)量了。不純化，PAGE純化，HPLC純化，到反相純化，有多大區(qū)別？純化過的DNA oligo是不就去除了全部錯誤序列呢？我們得先從DNA合成的錯誤成因談起：

1. 內(nèi)部缺失（n-1，n-2 etc）產(chǎn)物。這是化學(xué)合成DNA zui普遍與zui主要的限制因素，且不能通過純化DNA oligo來解決這個問題?；瘜W(xué)合成DNA不及活細胞內(nèi)DNA復(fù)制具有高保真性，在活細胞內(nèi)，存在大量的校正與修復(fù)系統(tǒng)，將堿基突變率降低至1/(1×106)以下。PCR反應(yīng)也具有較高的保真度，例如：錯誤率在1/1000——1/10000，并且還可通過DNA 聚合酶的性能提高保真度。但是化學(xué)合成DNA不同，每單個合成循環(huán)的錯誤率約為1/100，隨堿基數(shù)目增加而增加。其原因包括：

(1)DNA oligo的化學(xué)合成是堿基與堿基之間通過化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)而成，而化學(xué)反應(yīng)的偶聯(lián)效率一般在99%左右，也就是說，在每次進行偶聯(lián)反應(yīng)時，都會有1%的DNA片段附加不上新的堿基，對這種截斷的失敗序列，為了防止其參與后續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)，采用CapA與CapB進行化學(xué)封閉，以阻斷其延伸，但化學(xué)封閉反應(yīng)的效率不可能達到100%。導(dǎo)致出現(xiàn)合成失敗的DNA片段或截斷序列殘留在合成的DNA粗制品中。

(2)DNA oligo的不*脫保護。寡核苷酸的*脫保護包括從磷酸酯基團、堿基上的環(huán)外氨基和5′-OH部分上去掉保護基團。脫保護的化學(xué)反應(yīng)效率不可能達到100%，未脫保護的堿基無法參加偶聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致DNA oligo內(nèi)部缺失堿基。

(3)不斷延長的DNA鏈與不斷累積的副產(chǎn)物會干擾DNA oligo的化學(xué)合成。

對于以上三方面問題，至今為止還沒有找到一個的解決方案。因為延長蓋帽時間也不能保證封閉反應(yīng)效率達到100%；而對于脫保護反應(yīng)來說，增加脫保護試劑量及延長脫保護時間又會導(dǎo)致DNA oligo脫嘌呤。因此只能采取折衷方法將不*脫保護與脫嘌呤同時控制在低水平上。內(nèi)部缺失堿基的截斷序列絕不可能100%去除干凈，對于幾種純化方法來說，OPC或HPLC不可能去除內(nèi)部缺失堿基的截斷序列，的方法是通過PAGE純化降低截斷序列數(shù)量。

2.　單核苷酸的插入是存在于目的DNA oligo產(chǎn)物中的另一種常見的序列錯誤。

當同一DNA oligo分子中存在G-偶聯(lián)或單堿基插入(n+1)同時又存在單堿基缺失（n-1）時，此條DNA oligo的長度與目的DNA分子的長度相同，因此無法通過OPC 、HPLC或PAGE純化將此“失敗序列”去除。 DNA oligo化學(xué)合成存在的這些弊端曾被Hecker KH與Rill R報道過（Error analysis of chemically synthesized polynucleotides.　Biotechniques，1998 Feb；24：256-260）。在這篇文章中，作者合成并PAGE純化了長鏈DNA oligo，用它們進行PCR克隆，然后測序鑒定了10個克隆，發(fā)現(xiàn)存在7個單堿基缺失，一個連續(xù)的4個堿基缺失，一個G-C替換。除了這些堿基錯誤，其它學(xué)者還曾報道存在G-偶聯(lián)、分支及其n+x產(chǎn)物。

為了解決上述堿基出錯的問題，首先要優(yōu)化化學(xué)合成方法來提高DNA oligo的純度，并且對DNA oligo粗制品進行純化，雖然無論哪種純化方式都不能保證去除錯誤序列，但能改善產(chǎn)品的純度，進而提高實驗的成功率。Oligo的純化方式常見的有脫鹽、OPC、PAGE和HPLC。脫鹽只能去除氨、鹽等雜質(zhì)，而不能有效去除合成過程中產(chǎn)生的短片段，因此一般只能用于普通的PCR反應(yīng)和測序。HPLC和PAGE純化得到的純度很高，但只能進行手工操作，相當費時費力。OPC不僅能去除短片段，當DNA oligo的長度在40 bases以內(nèi)，其純度與HPLC或PAGE純化的純度相當，而且由于簡便、快捷，能進行高通量（high-throughput）和自動化（automation）操作，因而受到很多DNA合成公司的青睞。

但OPC純化也有一個缺點，就是在操作過程中需要一種弱酸脫掉DMT基團，而DNA Oligo在酸性條件下容易脫嘌呤（depurination）。對于脫嘌呤后的堿基，DNA聚合酶不能識別，可能導(dǎo)致PCR擴增后出現(xiàn)堿基缺失或錯配。因此，有些公司不推薦OPC純化用于克隆、突變、基因合成等實驗。

一般來說，不同廠家的合成方法其實并沒有什么大的本質(zhì)的區(qū)別，只是有一些經(jīng)驗的積累和技巧。比如脫保護劑濃度的選擇很重要，太低脫保護不*，太高又增加脫嘌呤的機率，還有如何優(yōu)化程序，使蓋帽更充分、更*等等…。純化方式的選擇，一般說來修飾標記要用HPLC純化，長鏈要用PAGE 純化，但這兩種純化方式都非常費時耗力。