近期我司新推出升級了hiPSC人多能干細胞產(chǎn)品
細胞名稱：hiPSC人多能干細胞
組織來源：內(nèi)細胞團
性別來源：男性
細胞形態(tài)：球形克隆
生長特性：貼壁生長
支原體檢測：陰性
背景簡介：hiPSC細胞株來源于ATCC，是將健康男性新生兒包皮細胞誘導成hiPSC，貼壁生長，呈克隆狀，可在hESC/iPSC專用培養(yǎng)基中快速增殖，而邊緣分化的細胞則在該培養(yǎng)基中生長較慢，從而選擇性擴增并獲得高純度人多能干細胞
細/胞/鑒/定
結(jié)果分析
本項目的實驗目的是培養(yǎng)人多能干細胞hiPSC并通過電鏡觀察，熒光免疫法，流式細胞法來進行鑒定，以上結(jié)果顯示，本公司培養(yǎng)人多能干細胞hiPSC鑒定正確，可供科研使用。
試/劑/準/備
1.專用培養(yǎng)基配制（500 mL）
1. 在4℃條件下解凍hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37℃培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍。
2. 參考表1在生物安全柜中，使用無菌移液管混勻下列成分配制成hESC/iPSC專用培養(yǎng)基，之后置于4℃儲存，封口膜封好后2周內(nèi)使用。
3. 有初培養(yǎng)需擴建的需求，建議先配置100 mL，保證2周內(nèi)使用完畢。
可根據(jù)實際用量將hESC/iPSC Grouth Supplements A/B分裝后冷凍保存。具體配置比例可參考表3的配置說明。hESC/iPSC Grouth Supplements A/B凍融總次數(shù)不能超過2次。
2.Matrigel鋪板
A. 分裝 Matrigel
1. 貨號354277的Matrigel，操作說明中不標注蛋白濃度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推薦Dilution Factor為278 μL，則表明278 μL可包被4塊6孔板，分裝數(shù)量=5 mL /0.278=17.98。
2. 準備18個無菌1.5 mL EP管，標記Matrigel日期、操作人；1mL無菌吸頭；EP管架，均置于-20℃冰箱中預冷1小時。
3. 將Matrigel放置4℃冰箱過夜解凍，當Matrigel解凍即可開始分裝。
注：在解凍時，將Matrigel放置冰箱內(nèi)側(cè)角落，切勿放在靠近冰箱門附近。
4. 準備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel、預冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸頭放置于生物安全柜上。
5. 混勻Matrigel，無菌分裝于各個1.5 mL EP管中，并置于冰上。當吸頭被堵塞可能導致分裝體積不準時需要更換吸頭。
6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。
B. 鋪板
1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL離心管中，準備4個6孔板，標記Matrigel、批號、日期和操作人。
2. 1 mL無菌吸頭置于-20℃冰箱中預冷1小時，取出一支冷凍的Matrigel（5mL）置于4℃冰箱解凍至化凍。
3. 準備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel、預冷的1mL吸頭放置于生物安全柜上。
4. 用預冷吸頭向解凍過的Matrigel（5mL）加入1 mL冷的DMEM/F12并反復吹打解凍混勻。
5. 吸出已解凍混勻的Matrigel加入離心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反復吹打混勻。
6. 分裝1.5 mL/孔于4個六孔板中，輕輕搖晃混勻。
7. 培養(yǎng)板置于室溫1小時后即可使用，或置于4℃冷藏過夜，兩周內(nèi)使用。
培/養(yǎng)/操/作
1.復蘇hESC/iPSC
1. 將水浴鍋預熱至37℃；并將Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復至室溫（15~30℃）。
2. 取4 mL hESC/iPSC專用培養(yǎng)基，按照1:4000比例加入1 μL的hESC/iPSC Supplement C，恢復至室溫（15~30℃）。
注意：不要在37℃水浴鍋中預溫培養(yǎng)基。
3. 取出1支冷凍的細胞置于37℃水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min內(nèi)解凍，肉眼觀察細胞懸液內(nèi)冰晶即將消失時取出。
4. 75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面，轉(zhuǎn)入生物安全柜；將細胞懸液移到事先準備好的15 mL 離心管中，隨后緩慢逐滴加入10mL DMEM/F12，過程中輕柔晃動混勻細胞，160g離心5 min。
5. 吸棄上清，加入預溫的4 mL的hESC/iPSC專用培養(yǎng)基+hESC/iPSC Supplement C制備細胞懸液，盡量避免吹打。
注：可留20 μL上清液，輕彈管底，使細胞懸浮液更均勻，避免成較大細胞團。
6. 吸除6孔板中2孔的Matrigel包被液，將細胞懸液按照2 mL/孔接種到1個孔中。
7. 水平十字搖勻三次，置于37℃，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻三次培養(yǎng)。
8. 18-24小時后換新的hESC/iPSC專用培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基。
注：在hiPSC培養(yǎng)過程中，如果細胞的匯合度超過50%，建議更換培養(yǎng)基時，培養(yǎng)基的體積增加至3-4mL/孔。
2.傳代hESC/iPSC
1.傳代條件
① 細胞匯合度達85%左右（如圖1(C-D)所示），一般情況下每3-4天傳代；
② 細胞匯合度較低，生長密度分布不均勻。
注：即使克隆團較小、匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過5天。
2.傳代比例
可根據(jù)細胞生長狀態(tài)和實驗需要按1:5~1:12的比例進行傳代，如果細胞正常，克隆團匯合度85%，大小均勻（如圖1(C-D)所示），建議按照1:8進行傳代，如果密度偏低，則可降低傳代比例；密度偏高，則增加傳代比例。
注：1:8傳代就是1個孔瓶傳8個孔（以6孔板為例）。
3. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復至室溫（~25℃）。
4. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準備2 mL/孔的hESC/iPSC專用培養(yǎng)基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢復至室溫（~25℃）。
5. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復至室溫（~25℃）。
6. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準備2 mL/孔的hESC/iPSC專用培養(yǎng)基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢復至室溫（~25℃）。
7. 將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸取，加入2 mL/孔的DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃并吸取。
8. 加入2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液覆蓋孔底。
9. 置于37℃培養(yǎng)箱中孵育8-9 min。
注：① 消化8-9 min后鏡下觀察細胞變化，當大部分細胞變亮變圓，且細胞尚未脫離基質(zhì)或漂起時即可終止消化，若大部分細胞仍未變亮，則需要延長消化時間；
② 保持6孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸，使6孔板受熱均勻，不要疊放。
圖1. hESC/iPSC專用培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)hiPSC細胞形態(tài)圖：（A）和（C）分別為hiPSC細胞培養(yǎng)第2和4天時低倍鏡hiPSC培養(yǎng)形態(tài)圖示，（B）和（D）為培養(yǎng)至第2和4天時的高倍鏡hiPSC培養(yǎng)形態(tài)圖。
10. 消化結(jié)束后輕輕地將細胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜，避免震蕩搖晃細胞，傾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。
11. 及時加入2 mL/孔預溫的hESC/iPSC專用培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字搖晃6孔板使細胞脫離基質(zhì)。
注：① 加hESC/iPSC專用培養(yǎng)基 + hESC/iPSC Supplement C時，可輕柔吹打細胞1-2次，不能超過2次，避免反復吹打；有部分細胞（10%～15%）未脫離基質(zhì)是正?，F(xiàn)象，若有大量細胞未脫離則需延長消化時間（< 10min）。
圖2：消化hiPSC細胞不同時間形態(tài)圖：（A）消化8 min低倍鏡hiPSC培養(yǎng)的的形態(tài)圖;（B）消化9 min低倍鏡hiPSC培養(yǎng)的的形態(tài)圖。
②hiPSC細胞不能長時間處于hESC/iPSC Passage Solution（<15 min），所以收集接種細胞時操作必須快速,以及最好一次操作不要超過4孔（六孔板）。
12. 吸取6孔板中的Matrigel溶液，加入預溫的hESC/iPSC專用培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。
13. 在6孔板上標記細胞名稱、代次、傳代比例、日期、操作人。將步驟9獲得的細胞懸液輕輕搖勻，按預先設(shè)定的傳代比例均勻分配于孔板中。
注：為了鋪板均勻并降低對細胞的損傷，可以將步驟9獲得的細胞懸液收集至2mL離心管，輕柔顛倒混勻細胞1-2次；再按照傳代比例接種。
14. 接種后，水平十字搖勻6孔板三次，置于37℃，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中， 再次水平十字搖勻6孔板三次，培養(yǎng)過夜。
15. 18-24小時后更換新hESC/iPSC專用培養(yǎng)基，此后每天換液，4-5天后繼續(xù)傳代/凍存。
3.凍存hESC/iPSC
1. 當細胞匯合度達85%左右（如圖1(C-D)所示）可收獲凍存，一般6孔板每孔可凍存1管。
2. 準備相應(yīng)數(shù)量的1.5/2 mL凍存管，標記細胞名稱、代次（P#）、日期、操作人。
3. 取出4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室溫預溫，使用前注意搖勻。
4. 吸取上清液，加入2 mL/孔的DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃數(shù)次，再吸取。
5. 加入2 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，將細胞置于37℃培養(yǎng)箱中，計時8-9 min（可參考“傳代hESC/iPSC"步驟）。
6. 消化結(jié)束，輕輕取出培養(yǎng)板，吸取hESC/iPSC Passage Solution。
7. 搖勻預溫的hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入1 mL凍存液，輕柔吹打，水平十字搖勻3次，隨后吸取細胞懸液加入1.5/2 mL凍存管中。
8. 將細胞置于梯度程序降溫盒中，并置-80℃冰箱中過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存。
備注：以上操作全部以6孔板為例
注/意/事/項
1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，干冰運輸?shù)募毎麢z查干冰是否揮發(fā)，細胞是否解凍，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。
2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關(guān)信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導致細胞出現(xiàn)問題，責任由客戶自行承擔。
3. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。
4. 建議客戶復蘇細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運輸?shù)脑颍毎麜霈F(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。
5. 該細胞僅供科研使用。
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