DYKDDDDK-Nanoab-Agarose
貨號(hào):FNA-25-500 FNA-50-1000
保存條件:4℃一年;-80℃長(zhǎng)期保存,避免反復(fù)凍融
產(chǎn)品描述
偶聯(lián)anti-DYKDDDDK-tag納米抗體的瓊脂糖珠子用于免疫沉淀DYKDDDDK-tag (DYKDDDDK)融合蛋白。
產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)
l 沒(méi)有普通抗體的輕鏈和重鏈;
l 即用型,節(jié)約時(shí)間;
l 高親和力,高載量;
應(yīng)用范圍
可用于免疫沉淀(IP)/免疫共沉淀(CoIP)、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)/RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)、酶活性測(cè)定、質(zhì)譜分析等;
特異性
特異性結(jié)合DYKDDDDK-tag。
產(chǎn)品特性
存儲(chǔ)緩沖液:PBS(含有20%乙醇)。
保存條件:可在4℃保存1年(確保wan全密封),或在-80℃長(zhǎng)期保存,避免反復(fù)凍融。
實(shí)驗(yàn)步驟:
收集細(xì)胞
每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)大約使用 106-107 個(gè)表達(dá)DYKDDDDK-tag融合蛋白的細(xì)胞,可根據(jù)DYKDDDDK-tag融合蛋白表達(dá)量適當(dāng)調(diào)整細(xì)胞數(shù)。吸出培養(yǎng)基,向培養(yǎng)皿中加入預(yù)冷的1×PBS,漂洗2次,利用細(xì)胞刮或yi酶消化收集貼壁細(xì)胞,細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管,500g離心3min并丟棄上清液。
植物組織裂解處理:
取適量植物組織樣本(葉片等)放置于冷凍液氮中,之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進(jìn)行研磨,盡可能充分研磨破壞其細(xì)胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液(已加蛋白酶抑制劑 PMSF 等)進(jìn)行裂解,為了提高裂解效率,加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min,裂解完成后 12000 rpm,離心 30min,吸取上清 置新的離心管中,棄去沉淀。
細(xì)胞裂解
1.在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑,用500μl預(yù)冷的裂解緩沖液重懸細(xì)胞。
2.置于冰上30分鐘,可每10分鐘充分吹打一次。
3.4℃,20,000g離心15分鐘,將裂解產(chǎn)物(上清)轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的預(yù)冷管中,丟棄沉淀。
注意:此時(shí)細(xì)胞裂解產(chǎn)物可長(zhǎng)期保存于-80℃。
結(jié)合蛋白
4.將20μl平衡好的DYKDDDDK-Nanoab-Agarose加入到細(xì)胞裂解產(chǎn)物中(可在細(xì)胞裂解產(chǎn)物中直接加入20μl該產(chǎn)品),于4℃旋轉(zhuǎn)混合結(jié)合1小時(shí)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可調(diào)整結(jié)合時(shí)間。如果需要,留存50μl的裂解產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡分析。
5.4℃,2,500g離心30秒,丟棄上清液。如果需要,留存50μl上清液進(jìn)行免疫印跡分析。
清洗珠子
6.用500μl預(yù)冷的裂解緩沖液中重懸5中的DYKDDDDK-Nanoab-Agarose,4℃,2,500g條件下離心30秒,丟棄上清液并重復(fù)洗滌3次。盡量減少清洗時(shí)間。
洗脫蛋白
方法一:
7. 加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸DYKDDDDK-Nanoab-Agarose。95℃,加熱10min充分變性,2,500g離心30秒收集上清,收集的產(chǎn)物可進(jìn)行SDS-PAGE及免疫印跡分析。
方法二:
8. 替代步驟7的可選步驟:加入50μl 0.2M pH2.5的gan氨酸洗脫結(jié)合的蛋白,孵育時(shí)間30秒,期間不斷混勻,2,500g離心30秒收集上清,立即加入5μl 1.0M Tris(pH10.4)以中和酸性的gan氨酸。如果洗脫的蛋白含量少,可嘗試用2×DYKDDDDK-tag進(jìn)行親和純化。
注意:為了提高洗脫效率可以重復(fù)這一步。
可選方案
方案一:
如需進(jìn)行DYKDDDDK融合酶的活性檢測(cè),無(wú)需洗脫,可以直接檢測(cè)。
方案二:
如需進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn),主要用于含有DYKDDDDK融合蛋白的蛋白質(zhì)/DNA相互作用的實(shí)驗(yàn)。染色質(zhì)免疫沉淀一般包括細(xì)胞固定,染色質(zhì)斷裂,染色質(zhì)免疫沉淀,聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn),DNA的純化以及DNA的鑒定。其中前期細(xì)胞固定,染色質(zhì)斷裂不變;然后接著直接進(jìn)入說(shuō)明書的第4步,加入細(xì)胞裂解產(chǎn)物后,DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合到DYKDDDDK-Nanoab-Agarose上;
進(jìn)入第5和6步,分離得到復(fù)合物;進(jìn)入第8步,得到洗脫的復(fù)合物;后期交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn),DNA的純化及DNA的鑒定等同于普通的ChIP實(shí)驗(yàn)。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn)步驟同上。
方案三:
DYKDDDDK-Nanoab-Agarose 不僅可以用于在體內(nèi)外檢測(cè)和驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間的相互作用,也可以結(jié)合質(zhì)譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步驟同免疫沉淀法,得到洗脫的復(fù)合物后,然后進(jìn)行SDS–PAGE分析,用考馬斯亮藍(lán)或者銀染的方法染色后,切下未知蛋白的條帶,用質(zhì)譜技術(shù)鑒定未知蛋白。