維生素E（Vitamin E，VE）試劑盒說(shuō)明書
微量法100T/48S
測(cè)定意義：
維生素E（Vitamin E）是一種脂溶性維生素，其水解產(chǎn)物為生育酚，是生物體中最主要的抗氧化劑之一，能阻止不飽和脂肪酸收到過(guò)氧化作用的損傷，維持不飽和脂肪酸細(xì)胞膜的完整性和正常功能，具有延緩衰老、預(yù)防溶血性貧血作用，在醫(yī)藥、化妝品、保健品、食品行業(yè)具有較高的應(yīng)用價(jià)值。
測(cè)定原理：
VE還原Fe3+為Fe2+，Fe2+與1,10-菲羅啉產(chǎn)生有色絡(luò)合物，在530nm有特征吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、研缽、離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、漩渦震蕩儀。
試劑組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑二：液體2mL×1支，4℃保存。
試劑三：液體2mL×1支，4℃保存。
試劑四：液體6mL×1瓶，4℃保存。
樣本處理：
1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，勻漿后用提取液定至1mL，定至在漩渦混勻儀上震蕩5min，于25℃，5000g離心10min，取上層測(cè)定。
2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）后在漩渦混勻儀上震蕩5min，于25℃，5000g離心10min，取上層測(cè)定。
3. 血清：取0.1mL，加0.9mL提取液，漩渦儀混勻上震蕩5min，于25℃，5000g離心10min，取上層測(cè)定。
測(cè)定操作：
對(duì)照管 | 測(cè)定管 | |
樣品（μL） | 100 | 100 |
試劑一（μL） | 20 | 20 |
試劑二（μL） | 20 | |
試劑三（μL） | 20 | |
充分混勻，25℃反應(yīng)5min | ||
試劑四（μL） | 60 | 60 |
充分混勻，于微量石英比色皿/96孔板，無(wú)水乙醇調(diào)零，測(cè)定530nm處吸光值，記為A對(duì)照管和A測(cè)定管，△A=A測(cè)定管-A對(duì)照管。 | ||
計(jì)算公式：
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.22x + 0.0065 R2 = 0.9978
1. 按照蛋白含量計(jì)算
VE含量（μg/mg prot）=（△A -0.0065）÷ 0.22×V反總÷（V樣×Cpr）
= 9.09×（△A -0.0065）÷ Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
VE含量（μg/g）= （△A -0.0065）÷ 0.22×V反總÷（V樣×W÷V樣總）
= 9.09×（△A -0.0065）÷ W
3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
VE含量（μg/104 cell）=（△A -0.0065）÷ 0.22×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）
= 9.09×（△A -0.0065）÷ 細(xì)胞數(shù)量
4. 按照液體體積計(jì)算
VE含量（μg/mL）=（△A -0.0065）÷ 0.22×V反總÷V樣×10
= 90.9×（△A -0.0065）
V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g
b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.11x + 0.0065 R2 = 0.9978
1. 按照蛋白含量計(jì)算
VE含量（μg/mg prot）=（△A -0.0065）÷ 0.11×V反總÷（V樣×Cpr）
= 18.18×（△A -0.0065）÷ Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
VE含量（μg/g）= （△A -0.0065）÷0.11×V反總÷（V樣×W÷V樣總）
= 18.18×（△A -0.0065）÷ W
3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
VE含量（μg/104 cell）=（△A -0.0065）÷ 0.11×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）
= 18.18×（△A -0.0065）÷ 細(xì)胞數(shù)量
4. 按照液體體積計(jì)算
VE含量（μg/mL）=（△A -0.0065）÷0.11×V反總÷V樣×10
= 181.8×（△A -0.0065）
V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g
注意事項(xiàng)：
若反應(yīng)體系產(chǎn)生沉淀，需要將樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，并在?jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
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優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司 | 下載次數(shù) |
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資料大小 |
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WORD 文檔 |
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