脂肪酸合成酶（FAS）活性試劑盒說(shuō)明書
微量法100T/96S
注 意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
FAS是脂肪酸合成關(guān)鍵酶，催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成長(zhǎng)鏈脂肪酸。FAS普遍表達(dá)于各種組織細(xì)胞中，在哺乳動(dòng)物肝、腎、腦、肺和乳腺以及脂肪組織中表達(dá)豐富。
測(cè)定原理：
FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成長(zhǎng)鏈脂肪酸和NADP+；NADPH在340nm有吸收峰，而NADP+沒有；通過(guò)測(cè)定340nm 光吸收下降速率，計(jì)算FAS活性。
自備儀器和用品：
研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體100mL×1瓶，－20℃保存。用前1d取出置于4℃充分解凍后混勻。
試劑二：粉劑×1瓶。臨用前加入440μL試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入440μL試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑四：液體20mL×1瓶, 4℃保存。
試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入840μL試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
粗酶液提?。?/span>
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心40min，取上清置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后12000g，4℃，離心40min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 血清等液體：直接測(cè)定。
FAS測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑四置于40℃水浴中預(yù)熱30 min。
3. 在96孔板或EP管中依次加入20μL上清液、4μL試劑二、4μL試劑三、164μL試劑四和8μL試劑五，混勻后于340nm處測(cè)定吸光值，記錄第30s和90s時(shí)吸光值，分別記錄為A1和A2。△A測(cè)=A1-A2。
FAS活性計(jì)算：
a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1）按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(Cpr×V樣)÷T
=1608×△A÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=1608×△A ÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1608×△A ÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：37℃中每毫升樣本每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷V樣÷T
=1608×△A
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。
b. 使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1）按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109)÷(Cpr×V樣)÷T
=3216×△A÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=3216×△A÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反總×109)÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=3216×△A÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：37℃中每毫升樣本每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個(gè)酶活單位。
FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109 )÷V樣÷T
=3216×△A
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。
提供商 |
優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司 | 下載次數(shù) |
32次 |
資料大小 |
34.5KB | 資料類型 |
WORD 文檔 |
資料圖片 |
點(diǎn)擊查看 | 瀏覽次數(shù) |
339次 |
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
會(huì)員.png)
4
立即詢價(jià)
您提交后，專屬客服將第一時(shí)間為您服務(wù)