激光掃描共聚焦顯微鏡（K1-Fluo）在光學顯微鏡的基礎上結合了激光和計算機圖像處理技術，把光學顯微鏡的分辨率提高了30-40%，其光學切片能使觀察組織，細胞的三維結構成為可能。本文著重介紹了共聚焦顯微鏡在生物學領域的應用，樣品的三維定量測量，活細胞的動態(tài)信號監(jiān)測并探討了激光共聚焦顯微鏡子啊生物學的應用前景。

與傳統(tǒng)的光學顯微鏡相比，激光共聚焦顯微鏡(K1-Fluo)能提供高清晰的三維圖像，在材料學（半導體工業(yè)），地質(zhì)學，醫(yī)學和生物學等領域中有著廣泛的應用。

生物用共聚焦顯微鏡大多是在熒光顯微鏡成像的基礎上,以紫外線可見激光激發(fā)熒光物質(zhì),得到細胞或組織內(nèi)部微細結構的熒光圖像。不同的結構有各自性的滎光染料 ,有些甚至可以在活細胞上非創(chuàng)傷性地進行染色,在亞細胞水平上觀察諸如 CapH、膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的動態(tài)變化 ,特別是在結合了先進的生物學技術以后,更成為藥理學，形態(tài)學，細胞生物學，神經(jīng)科學，研究中強有力的新一代研究工具。下文引述的共聚焦顯微鏡均以生物用熒光共聚焦顯微鏡為例。

2.傳統(tǒng)熒光顯微鏡的不足

使用熒光物質(zhì)標志細胞中的特定結構,不僅圖像與背景的對比度增強.而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光,大大提高了分辨率(8=0.61 入/NA其中6為顯微鏡的分辨率入為照明光線的波長 ;NA 為物鏡的數(shù)值孔徑)。但當所觀察的熒光標本稍厚時,傳統(tǒng)光顯微鏡一個難以克服的缺點就顯現(xiàn)出來:焦平面以外的熒光結構模糊、發(fā)虛。原因是大多數(shù)生物學標本是層次區(qū)別的重疊結構(如耳蝸基底膜.其實是外毛細胞、多種支持細胞神經(jīng)纖維等組成的空間結構).在普通光學顯微鏡下聚焦平面的變化,會表現(xiàn)出不同的形態(tài)。假若熒光標記的結構在不同層次上都有分布,且重疊在一起反射熒光顯微鏡(epifluorescent microscope)不僅從焦平面上收集光量而且來自焦平面上方 或下方的散射熒光也被物鏡所接收.熒光顯微鏡的光學分辨率就要大大降低。

3. 共聚焦顯微鏡的成像原理及技術

共聚焦顯微鏡成功地解決了上述問題，只有焦平面上的點才得到探測。它采用點光源(point lightsource)照射標本,在焦平面上形成了一個輪廓分明的小的光點(light spot),該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構成的分光器(beam splitter)。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔(pinhole).分別稱為照明針孔和探測針孔。二者的幾何尺寸一致,約 0.1~0.2m;相對于焦平面上的光點。二者是共輒的,即:光點通過一系列的透鏡 最終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。

這樣,來自焦平面的光,可以會聚在探測針孔范圍之內(nèi),而其它來自焦平面上方或下方的散射光,都被擋在探測針孔之外而不能成象。以激光逐點掃描樣品,探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像,轉(zhuǎn)為為數(shù)字量傳輸至計算機 最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。每一幅焦平面圖像實際上是標本的光學橫斷面,這個光學橫斷面總是有一定厚度的,又稱之為光學薄片(Optical slice)。共聚焦顯微鏡光學分辨率及其光學薄片厚度,與光的波長有關,也取決于物鏡的數(shù)值孔徑和針孔的直徑。如果探測器的針孔較大,光學薄片即變得較厚,那么所獲得的圖像與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡無異。

以一個微動步進馬達(最小步距可達 0.1m)控制載物臺的升降使焦平面依次位于標本的不同層面上,則可以逐層獲得物體光學橫斷面的圖像,這稱為“光學切片"(Optical sectioning)。獲得真正意義上的標本的三維數(shù)據(jù),可以利用多種計算機圖像處理及三維重建軟件,沿 xy 軸或其它任意角度來表現(xiàn)標本的外形剖面,十分靈活、直觀進行形態(tài)學觀察

4. 共聚焦顯微鏡地生物學應用

4.1 細胞，組織的三維觀察和定量測量

掃描電鏡已在觀察細胞超微結構的三維圖像方面獲得極大的成功,其分辨率是光鏡(包括共聚焦顯微鏡)所不可比擬的。但其樣本的制備過程相對復雜,所需的設備條件要求較高,并可能造成某些結構的缺失或改變。共聚焦顯微鏡的分辨率超過普通光鏡.染色過程簡便.甚至可以在活細胞上進行無創(chuàng)傷性的染色,維持細胞的正常形態(tài)。多種特異性的熒光染料 如AO (Acridine orange)、PI (Propidium iodide)、DAPI, Rhodamine、鬼筆毒環(huán)肽(Phalloidin)和DiI等,已被廣泛地用于諸如 RNA,DNA細胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肌動蛋白、細胞膜等結構的標記。運用免疫熒光技術,將不同波長 的兩三種熒光物質(zhì)標記在內(nèi)部不同結構的相應抗體上,以這幾種熒光物質(zhì)特定的光譜特性選擇激發(fā)光和濾光片 ,則可以觀察到細胞內(nèi)部各結構的間毗鄰關系。特別是在熒光著色點較小易被遮蓋(如熒光原位雜交實驗)的情況下,這種三維圖像的多角度觀察提供了極大的*性

細胞有絲分裂中細胞核內(nèi)染色體數(shù)目(雙倍體、多倍體)、形態(tài)和位置的變化.一直是細胞生物學腫瘤研究中的熱點。著絲點是細胞核內(nèi)的重要結構被認為在有絲分裂中起重要的作用,應用共聚焦顯微鏡的定量測量技術,可以較精確地測定著絲點在不同分裂期的位置。

共聚焦顯微鏡生成厚度小于 0.2 微米的依次相連的光學切片 .使較厚的組織的三維數(shù)據(jù)也可被計算機獲取,運用適當?shù)膱D像分析軟件 .可以測量并確定所觀察結構的表面特征,體積等參數(shù),為三維定量測量提供了新手段。

4.2 活細胞生理信號的動態(tài)監(jiān)測

活細胞的功能監(jiān)測在細胞生物學、神經(jīng)生理學、藥理學等領域都有重要意義。許多熒光染料可以聚集在細胞的特定結構,而對細胞的活性基本上不產(chǎn)生影響?？梢岳眠@一特性來反映細胞受到刺激后形態(tài)或功能的改變。如親脂性染料 DiOC6主要聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER),且對細胞的毒副作用極小。肌細胞中的肌漿網(wǎng)(Sarcoplasmic reticulum,SR)與 ER 有相同的屬性,是胞內(nèi)鈣庫,應用共聚焦顯微鏡,就可以動態(tài)觀察肌細胞興奮時 SR 的變化。

神經(jīng)生理學家多年來一直期望能直接用肉眼觀察到神經(jīng)通路的興奮傳導,應用共聚焦顯微鏡就可觀察用電壓敏感性染料或離子敏感性染料著色的腦片深層神經(jīng)元動作電位的傳導或與其伴隨的離子的進出。從而為神經(jīng)回路、神經(jīng)網(wǎng)絡的研究提供了第一手的資料。

總之.共聚焦顯微鏡利用熒光染料,從形態(tài)和功能兩個方面為生物學研究提供了嶄新技術手段。

5. 共聚焦顯微鏡的未來-激光細胞儀

共聚焦顯微鏡是以激光作為光源的，利用紫外或可見激光的生物學效能，可以進一步發(fā)展成激光細胞儀。

5.1 粘附細胞的分選

流式細胞儀可以實現(xiàn)游離細胞分選，如鑒別出二倍體和多倍體細胞。激光細胞儀則可能對貼附在培養(yǎng)皿底部的粘附細胞進行分選。將細胞貼壁培養(yǎng)在特質(zhì)培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)皿底部有一層特殊的膜,用高能量激光在欲選細胞四周切割成八角形幾何形狀.掀去培養(yǎng)皿底部的膜.非選擇細胞則被去除。該分選方式特別適用于選擇數(shù)量極少的細胞.諸如突變細胞、轉(zhuǎn)化或雜交癌細胞。另一種細胞分選的方式是用高能量激光自動殺滅不需要細胞留下完整的活細胞亞群繼續(xù)培養(yǎng),這種方式適于對數(shù)量較多的細胞的選擇。

5.2 細胞激光顯微外科

可把激光作為一把“光子刀"，實現(xiàn)諸如細胞膜瞬間穿孔，線粒體或溶酶體等細胞器燒灼，染色體切割，神經(jīng)元凸起切除等一系列細胞“外科手術"。

5.3 光鑷

光鑷是利用激光的力學效應,將一個微米級大小的細胞器或其它結構鉗制于激光束的焦平面上,也稱為光陷阱(optical trap)。其原理,激光從上方進入顯微鏡的物鏡.光束內(nèi)聚在焦平面上形成光束狹部(beam waist),產(chǎn)生三維的光強梯度個微米級的物體就可被陷阱捕獲。顯微鏡的照明光線來自下方的聚光器

光鑷可以用來進行細胞融合(如卵細胞受精)、機械刺激或細胞骨架彈性測量等.特別是在測量植物細胞的細胞骨架時很有意義),因為植物有一層厚硬的細胞壁,不能像動物細胞那樣利用微操縱器對原生質(zhì)膜進行機械處理。

5.4 籠鎖化合物

現(xiàn)在許多重要的生物活性物質(zhì)(神經(jīng)遞質(zhì)、細胞內(nèi)第二信使)都有其籠鎖化合物合成)，如 Ca2的籠鎖化合物)主要有 Nitr - 5,DM -nitrophen。在籠鎖(caged)狀態(tài)下,其功能被封閉,一旦被特異波長(一般為紫外)的瞬間照射后.即被光活化而解籠鎖(uncaged),快速地恢復原有的活性和功能。這種方法提供了一種在時間和空間上可控的生物活性產(chǎn)物或其它化合物釋放的有效方法。

5.5 光漂白后的熒光恢復

FRAP 技術借助高強度脈沖式激光照射細胞的某一區(qū)域,從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅,該區(qū)域周圍的未淬滅的熒光分子將以一定速率向受照區(qū)域擴散,而此擴散速率可通過低強度激光掃描探測。在研究細胞骨架構成、跨膜大分子遷移率細胞膜流動性、胞間通訊等領域中有較大的意義

6. 結語

共聚焦顯微鏡對光學顯微鏡的成像原理作了改進，可進行細胞內(nèi)部結構的三維觀察和測量，同時又可以監(jiān)測許多生理信號的動態(tài)變化，特別是結合激光生物學的研究手段，在整個生物學研究領域都有著廣闊的前景。