熒光共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上，配以激光掃描裝置，通過可見光激發(fā)熒光探針，然后通過計算機(jī)圖像處理技術(shù)獲得細(xì)胞的圖像。不僅可以觀察固定的細(xì)胞和組織切片，還可以實(shí)時動態(tài)觀察和檢測活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子和離子。
如何對熒光共聚焦顯微鏡進(jìn)行動態(tài)觀察？
1、細(xì)胞內(nèi)鈣變化的實(shí)時定量測定。
2、測量細(xì)胞內(nèi)pH值的變化。
激光共聚焦顯微鏡是測量多種離子濃度并顯示其分布的有效工具。聚焦信息的有效識別使得在亞細(xì)胞水平顯示離子分布成為可能。熒光探針可用于測量單個細(xì)胞中的PH值以及活細(xì)胞中各種離子(Ca+、K+、Na+、Mg2+)的濃度和變化。一般來說，電生理記錄裝置和攝像技術(shù)可以快速檢測細(xì)胞內(nèi)離子量的變化，激光共聚焦技術(shù)可以提供更好的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中Ca+濃度動態(tài)變化的圖像，對研究Ca+的細(xì)胞內(nèi)動力學(xué)有意義。
3、檢測膜電位的變化。
單體在低電位時存在，發(fā)出綠色熒光，聚集體在高電位時發(fā)出紅色熒光。隨著電位的增加，紅色熒光也增加。
4、檢測細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生。
5、藥物篩選
藥物、病毒、細(xì)菌等的熒光標(biāo)記。當(dāng)檢測到藥物跨膜進(jìn)入組織或細(xì)胞時，可以檢測到藥物是否進(jìn)入，其位置含量和動態(tài)過程。
6、細(xì)胞對細(xì)胞通信的研究
激光共聚焦顯微鏡可以通過觀察縫隙連接分子在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移來測量一些傳遞細(xì)胞調(diào)控信息的離子和小分子。該技術(shù)可用于研究胚胎發(fā)育、生殖發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤發(fā)生等過程中縫隙連接通訊的基本機(jī)制和功能，也可用于識別對縫隙連接有潛在毒性的化學(xué)物質(zhì)。
7、觀察細(xì)胞遷移和生長。
熒光共聚焦顯微鏡大大提高了光子產(chǎn)生效率，樣品可以與毒性較小的染料結(jié)合，以減少每次掃描時激光束對細(xì)胞的損傷。LSCM可用于數(shù)小時的長期定時掃描，以記錄細(xì)胞遷移和生長等細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象。
8、熒光漂白恢復(fù)的檢測
當(dāng)一個細(xì)胞中的熒光分子被激光漂白或淬滅而失去發(fā)光能力時，相鄰細(xì)胞中未淬滅的熒光分子可以通過細(xì)胞間的縫隙擴(kuò)散到漂白的細(xì)胞中，從而恢復(fù)熒光。該技術(shù)可用于分析細(xì)胞生物學(xué)過程，如細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞膜上的受體流動和大分子組裝。
