通過將特定 J 聚集染料的 DMSO 溶液然后通過離心純化來制備大量 J 聚集體。將所得的 J 聚集體重新分散在 HEPES 緩沖液中，用于光學(xué)研究。染料和J-聚集體的光學(xué)特性如圖2a所示。以化合物 9 為例，比較了單體和 J-聚集體的光學(xué)性質(zhì)（圖 2a–2c）。如圖 2a 所示，化合物 9（單體）具有相對較寬的吸收帶，最長為 878 nm，而其 J 聚集體 （CYJ1007） 在1007 nm 處表現(xiàn)出尖銳、紅移和強(qiáng)烈的吸收帶，以及幾乎重疊的熒光帶。此外，CYJ1007顯示出強(qiáng)烈的丁達(dá)爾效應(yīng)，這是粒子形成的標(biāo)志。如在TEM上觀察到的那樣，顆粒呈現(xiàn)出球形形態(tài)。如圖 2b 所示，J 聚集體的熒光壽命比單體短得多，為 J 聚集體的形成提供了額外的證據(jù)。此外，圓二色性（CD）光譜（圖2c）顯示，單體在600 nm至1200 nm范圍內(nèi)不表現(xiàn)出CD信號，而J聚集體CJY1007在CYJ1007的吸收（1007 nm）處顯示出具有強(qiáng)烈、尖銳和負(fù)峰的CD信號，這可能是由J聚集體中的手性排列、激子耦合和/或長程有序引起的。

聚集體的形成相當(dāng)快，如將化合物9的DMSO溶液加入HEPES后10分鐘內(nèi)吸光度突然增加所證明的那樣（圖2d）?；衔?span style="box-sizing: border-box; font-weight: 700;">9在30nM至50nM之間的HEPES溶液中也表現(xiàn)出低臨界聚集濃度，同時在生物體液中具有很強(qiáng)的J聚集傾向。有趣的是，一些單體的吸收光譜幾乎相互重疊（圖2e），而其J聚集體的吸收光譜各不相同，范圍從1007 nm到1059 nm（圖2f）。J聚集體在生理pH值下還表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)膒H穩(wěn)定性，比單體具有更好的光穩(wěn)定性，并且在37°C下在FBS中具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。為了追求這些 J 聚集體在水性介質(zhì)中的更大穩(wěn)定性，這對于體內(nèi)光學(xué)成像至關(guān)重要，研究者將 J 聚集體封裝在 Pluronic F127 膠束中。值得注意的是，這種封裝僅引起其吸收光譜的微小變化，同時大大提高了它們的穩(wěn)定性。HEPES中封裝的J聚集體比商業(yè)和報道的NIR-II分子染料和水性介質(zhì)中的J-聚集體具有更窄的光譜帶。

從化合物 10 和 14 開始分析，這兩種化合物都不能形成 J 聚集體?；衔?span style="box-sizing: border-box; font-weight: 700;">10采用“人字形"堆疊（圖3a），相鄰堆疊在相反方向上“俯仰"和“滾動"，其相鄰分子在堆棧內(nèi)表現(xiàn)出較大的橫向位移（3.57 ?）（圖3a4），因此它們之間的π-π相互作用可以忽略不計。對于化合物14，其末端基團(tuán)高度扭曲和彎曲，兩個苯并吲哚平面之間具有較大的二面角（圖3b）。在14中，苯環(huán)直接連接到三氟乙胺基團(tuán)導(dǎo)致較大的空間位阻，使14成為“擁擠"的菁并抵消J聚集。顯然，10 和 14 的單晶中的堆積排列不利于 J 聚集。

化合物8、15、11、9、24和19在單晶中都表現(xiàn)出磚層堆積，其分子堆積排列的特點(diǎn)是縱向位移大，橫向位移小，有利于J聚集體的形成（圖3c-3e）。然而，觀察到化合物 8 和 15 盡管它們在分子結(jié)構(gòu)上與 9 高度相似（8 在介觀取代基處的乙酰基與三氟乙?；?span style="box-sizing: border-box; font-weight: 700;">，以及 15 在吲哚氮處的甲基與乙基），但未能形成 J 聚集體，而其他四種 （9、11、24 和 19） 可以。單晶是通過非常緩慢的溶劑擴(kuò)散過程生長的，該過程更像是熱力學(xué)上有利的過程。六種染料在單晶內(nèi)的分子排列表明它們可能具有形成J 聚集體的傾向。然而，與單晶相比，水介質(zhì)中J聚集體的形成更復(fù)雜、更迅速，動力學(xué)因素成為J聚集體形成的關(guān)鍵決定因素。8 中介消旋取代基上的乙?；?nbsp;15 中吲哚氮上的甲基與 9 中的對應(yīng)物相比尺寸相對較小。這可能導(dǎo)致 8 和 15 的分子振蕩增加，尤其是當(dāng)放置在水性介質(zhì)中時，從而降低它們的 J 聚集能力。關(guān)于9、24和19形成的三種單晶，它們都可以形成J聚集體，并且其結(jié)構(gòu)中具有苯吲哚末端基團(tuán)，觀察到它們的層間縱向位移（18.70、19.57和19.95 ?）與相應(yīng)的J聚集體表現(xiàn)出的吸收量（1007、1045和1059）之間存在正相關(guān)關(guān)系。

這些結(jié)果表明，單晶內(nèi)的堆積排列與J聚集之間存在有意義的相關(guān)性，這意味著理解單晶內(nèi)的分子堆積可能是評估染料J聚集傾向的寶貴方法。控制單晶內(nèi)分子堆積的各種力和空間位阻因素也可以在J聚集染料的設(shè)計中得到利用。

圖5.  1@β-LG （50 μM）、CYJ981@F127 （50 μM） 或 CYJ1059@F127 （50 μM） 注射三組染料三色MSOT成像

三色多光譜光聲斷層掃描 （MSOT） 成像是通過將三種染料注入小鼠體內(nèi)并在單次運(yùn)行中用多個 （13） 個波長照亮每個樣品（圖 5a）進(jìn)行的，然后進(jìn)行超聲檢測、重建和光譜分離。為了評估在多路 MSOT 成像框架內(nèi)三種染料之間的潛在串?dāng)_，進(jìn)行了一項評估，涉及皮下注射三種單獨(dú)的染料或三個染料組（標(biāo)記為 I、II 和 III 組，每組包含兩種不同的染料，如圖 5b 所示）到小鼠中。這些注射劑在小鼠的三個不同部位小心地進(jìn)行，分別位于背部、左腰部和右腰部。評估結(jié)果（圖5c和S62）表明，在這兩種實(shí)驗(yàn)場景中都不存在串?dāng)_。作為一個說明性的例子，當(dāng)將1@B-LG施用于小鼠的左腰（I組）和右腰（III組）時，從1@B-LG（左上圖）發(fā)出的MSOT信號精確地定位在左腰部和右腰部，確認(rèn)成像中沒有串?dāng)_（圖5c）。

隨后，進(jìn)行三色MSOT成像，以闡明三種染料給藥后的生物分布，成像過程的時間線如圖5d所示。將個體小鼠輕輕麻醉并小心地放置在成像室中進(jìn)行MSOT成像，其持續(xù)時間為-6分鐘至62分鐘。在0 min和10 min時，分別通過尾靜脈將CYJ981@F127和1@β-LG注射到小鼠胃中，而在20 min時通過管飼管將CYJ1059@F127遞送至小鼠胃底部。通過掃描小鼠腹部區(qū)域的特定部分獲得一堆橫截面（2D）MSOT圖像，這些橫截面圖像可以單獨(dú)檢查或渲染成3D表示（強(qiáng)度投影，MIP）。圖5e顯示了小鼠的冷凍切片圖像，其橫截面位置與圖5f中的橫截面位置相對應(yīng)。通過記錄每種染料的信號，可以監(jiān)測三種染料的生物分布，如單通道和復(fù)合圖像所示（圖5f）。顯而易見的是，1@β-LG選擇性地在兩個腎臟內(nèi)積累，而CYJ981@F127和CYJ1059@F127分別位于肝臟和腸道中。兩個感興趣區(qū)域的三色MSOT成像進(jìn)一步證實(shí)了這一觀察結(jié)果。此外，圖5g中的3D MSOT圖像提供了與三種染料分布相關(guān)的空間信息，使研究者能夠更精確地定位染料的生物分布。離體三色成像為三色MSOT成像提供了額外的證據(jù)。重要的是，染料的低細(xì)胞毒性和體內(nèi)毒性分別通過細(xì)胞毒性研究和主要解剖器官切片的蘇木精和伊紅（H&E）染色得到驗(yàn)證。

這項研究揭示了一種有前景的解決方案，通過在七亞甲基菁的介觀位置引入包含三氟乙?；鶈卧推S基單元的龐大支鏈結(jié)構(gòu)，確保J聚集體在NIR-II區(qū)域的吸收帶。通過對N-芐基部分的微小修飾，已經(jīng)獲得了一系列具有不同光譜性質(zhì)的J聚集體。已經(jīng)成功生長了九種單晶，對這些晶體學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較分析，這表明，當(dāng)染料的單晶結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出與J聚集一致的特征時，它可能具有形成J聚集體的內(nèi)在趨勢。此外，一系列 J 聚集體的可用性，其特點(diǎn)是具有有利的光譜特性，包括紅移和窄吸收/發(fā)射光譜以及增強(qiáng)的消光系數(shù)，能夠構(gòu)建用于多路復(fù)用三色 NIR-II 熒光和 MSOT 成像的染料組合，在無串?dāng)_的成像中實(shí)現(xiàn)顯著的時空精度。這項研究為生成具有所需光譜特性的J聚集體提供了一種有效且直接的方法。

參考文獻(xiàn)

Zhang C, Wu Y, Zeng F, et al. Structurally Modulated Formation of Cyanine J‐Aggregates with Sharp and Tunable Spectra for Multiplexed Optoacoustic and Fluorescence Bioimaging[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2024, 63(34): e202406694.