本文要點(diǎn)：具有擴(kuò)展共軛結(jié)構(gòu)的染料是研究者進(jìn)行設(shè)計(jì)和合成的重點(diǎn)，旨在進(jìn)一步提高并賦予染料光學(xué)和電子性能。這些設(shè)計(jì)使這些染料適用鄰域廣泛，從第二窗口近紅外（NIR-II）生物成像到有機(jī)光伏。然而，大共軛的固有優(yōu)勢(shì)往往伴隨著其他挑戰(zhàn)，如聚集、熒光淬滅、吸收藍(lán)移、低穩(wěn)定性和水溶性差。本文介紹了一種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)策略來(lái)解決這些問(wèn)題，將這種策略稱為“具有外部水合層的同源二元組"，為開(kāi)發(fā)具有長(zhǎng)吸收/發(fā)射波長(zhǎng)的成像探針量身定制。這種方法涉及通過(guò)柔性連接子將兩個(gè)七亞甲基花青結(jié)合在一起，形成同二元結(jié)構(gòu)，同時(shí)創(chuàng)新性地將四個(gè)聚乙二醇（PEG9）鏈連接到末端雜環(huán)上。這種方法賦予染料出色的水溶性、生物相容性，并增強(qiáng)了化學(xué)、光和光譜穩(wěn)定性。利用這一策略，開(kāi)發(fā)了一種用于NIR-II熒光和3D多光譜光聲斷層掃描成像的生物標(biāo)志物激活探針（HD-FL-4PEG9-N），及其在疾病可視化中的有效性。由于其高水溶性，它不僅可以用作急性腎損傷成像的可注射探針，還可以用作細(xì)菌感染傷口成像的可噴霧探針。

活體成像

方案1. 發(fā)色團(tuán) HD-FL-4PEG9、探針 HD-FL-4PEG9-N 和激活探針（響應(yīng)產(chǎn)物）HD-FL-4PEG9-NO 在探針對(duì) NO 的響應(yīng)時(shí)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

本文提出了一種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)策略“同二元與外部水化層方法"。這種設(shè)計(jì)復(fù)雜的方法旨在解決上述挑戰(zhàn)，并為設(shè)計(jì)具有長(zhǎng)吸收波長(zhǎng)的成像探針提供了一種易于操作的策略（方案1）。該策略的核心是將兩個(gè)七甲胺花青偶聯(lián)，使用相對(duì)靈活的連接子產(chǎn)生同位二元，該連接子放大空間過(guò)度擁擠以阻止反應(yīng)劑的攻擊，并避免兩個(gè)花青部分之間的大范圍π-π堆積，從而提高化學(xué)、光和光學(xué)光譜的穩(wěn)定性。這種方法的另一個(gè)方面涉及摻入四個(gè)聚（乙二醇）鏈（每個(gè)鏈包含九個(gè)重復(fù)單元的乙二醇，稱為PEG9）。這些PEG9鏈巧妙地位于分子支架的所有四個(gè)末端，當(dāng)在水中水合時(shí)，這些PEG9鏈在發(fā)色團(tuán)支架周圍形成外部水合層，因?yàn)镻EG是生物相容性和親水性聚合物。這種配置確保了染料在水性環(huán)境中的生物相容性、高溶解度和穩(wěn)定性。為了實(shí)現(xiàn)NIR-II光學(xué)成像，在二元組的兩個(gè)中間位置引入了生物標(biāo)志物響應(yīng)單元。所得探針名為HD-FL-4PEG9-N，具有高水溶性、化學(xué)/光/光譜穩(wěn)定性、良好的生物安全性和最少的蛋白質(zhì)結(jié)合。隨后，該探針在光學(xué)生物成像中用作藥物誘導(dǎo)的急性腎損傷的注射探針和細(xì)菌感染傷口的可噴霧探針。這允許通過(guò)原位生物標(biāo)志物（NO）激活的 NIR-II 熒光和光聲成像來(lái)可視化和監(jiān)測(cè)疾病。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了探頭優(yōu)異的成像性能。

圖2. HD-FL-4PEG9的光物理性質(zhì)

通過(guò)微觀取代法將仲胺基團(tuán)引入HD-FL-4PEG9的兩個(gè)介觀位置，使水溶性可激活探針（HD-FL-4PEG9-N）通過(guò)NIR-II熒光成像和3D-MOST成像檢測(cè)生物標(biāo)志物NO。在PBS（pH = 7.4,10 mm）中測(cè)試了探針HD-FL-4PEG9-N的光譜特性和對(duì)NO的響應(yīng)。在沒(méi)有NO的情況下，探針HD-FL-4PEG9-N的吸收帶在640nm處中心（圖2A）。然而，NO的存在和NO水平的增加（NO供體：MAHMA NONOate）導(dǎo)致640nm處的吸收降低，并且在835nm左右出現(xiàn)新的吸收峰，隨著NO水平的增加而逐漸增強(qiáng)。探頭HD-FL-4PEG9-N與不同NO水平反應(yīng)后的光聲強(qiáng)度如圖2B所示。相對(duì)光聲強(qiáng)度也隨著NO水平的增加而增強(qiáng)。圖2C，D顯示，對(duì)于探針HD-FL-4PEG9-N，隨著NO水平的增加，熒光強(qiáng)度（發(fā)射峰在926 nm）在900–1200 nm范圍內(nèi)增強(qiáng)，檢測(cè)限確定為0.21 μm;而在沒(méi)有NO的情況下，探針的熒光幾乎可以忽略不計(jì)。并且隨著NO與探針之間反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（圖2E），反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間小于10 min，這表明探針對(duì)NO的快速響應(yīng)。此外，MALDI-TOF質(zhì)譜法證實(shí)了HD-FL-4PEG9-N（探針）對(duì)NO的響應(yīng)機(jī)制。在用NO孵育后，在質(zhì)譜圖中，除了探針的m/z峰（1390.8405）外，還會(huì)出現(xiàn)另一個(gè)分子離子峰，該峰位于m/z 1419.8307處，與HD-FL-4PEG9-NO匹配。這證實(shí)了 HD-FL-4PEG9-NO 是由 NO 和 HD-FL-4PEG9-N 之間的反應(yīng)產(chǎn)生的。此外，為了研究HD-FL-4PEG9-N對(duì)NO的選擇性，HD-FL-4PEG9-N（探針）與各種潛在干擾物發(fā)生反應(yīng)。只有NO可以誘導(dǎo)熒光發(fā)射或光聲強(qiáng)度的增強(qiáng)，表明HD-FL-4PEG9-N對(duì)NO具有良好的選擇性。如圖2F所示，對(duì)于探針HD-FL-4PEG9-N或響應(yīng)產(chǎn)物（HD-FL-4PEG9-NO，在HD-FL-4PEG9-N與NO孵育后），即使在連續(xù)激光照射60分鐘后，吸光度也僅略有下降;相比之下，由于光漂白，ICG的吸光度顯著降低，表明與ICG相比，探針和響應(yīng)產(chǎn)物（活化探針）的光穩(wěn)定性要高得多。這些數(shù)據(jù)支持探針HD-FL-4PEG9-N可以快速響應(yīng)NO并產(chǎn)生光穩(wěn)定響應(yīng)產(chǎn)物HD-FL-4PEG9-NO（激活探針），從而相應(yīng)地產(chǎn)生可用于生物成像的NIR-II熒光和光聲信號(hào)。

圖3. 順鉑誘導(dǎo)的 AKI 小鼠模型的雙模式成像實(shí)驗(yàn)

急性腎損傷 （AKI） 是一種以腎功能迅速喪失為特征的病理疾病。在腎損傷部位，其中產(chǎn)生一氧化氮水平升高，進(jìn)一步加重腎損傷;因此，NO可以作為原位監(jiān)測(cè)腎損傷程度和恢復(fù)程度的內(nèi)源性生物標(biāo)志物。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用了順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠模型，該模型是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法腹腔注射順鉑建立的。然后，用N-乙?；?l-半胱氨酸（一種臨床使用的抗氧化劑，可保護(hù)腎臟免受腎毒性，稱為NAC）治療模型小鼠。采用純光學(xué)成像方法NIR-II熒光成像以及光學(xué)-超聲混合成像方法多光譜光聲斷層掃描（MSOT）成像監(jiān)測(cè)AKI的程度。光學(xué)-超聲混合MSOT成像可以呈現(xiàn)從投影圖像中獲得的高分辨率正交視圖3D圖像，有利于利用3D MSOT圖像提供的3D信息精確定位病變部位。實(shí)驗(yàn)過(guò)程如圖3A所示。對(duì)于AKI小鼠，NIR-II熒光信號(hào)在腎臟中穩(wěn)步增加，在約6小時(shí)達(dá)到峰值，然后由于腎臟代謝而減少。相反，健康小鼠（對(duì)照組）由于健康腎臟中的NO水平低，因此幾乎沒(méi)有熒光。值得注意的是，與沒(méi)有NAC治療的模型組相比，用NAC治療的小鼠的熒光信號(hào)要弱得多。圖3C顯示，與健康小鼠（對(duì)照組）和治療組（通過(guò)NAC治療的模型小鼠）相比，模型組的腎臟看起來(lái)更蒼白，更腫脹。此外，從圖3D，E中可以明顯看出，對(duì)于主要器官，模型組的腎臟顯示出更強(qiáng)的熒光信號(hào)，并且該結(jié)果與體內(nèi)NIR-II成像的數(shù)據(jù)一致。

隨后，探針HD-FL-4PEG9-N被用于小鼠順鉑誘導(dǎo)的AKI的MSOT成像。與對(duì)照組（健康小鼠）相比，順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠腎臟中的MSOT信號(hào)逐漸增加，在約6 h時(shí)達(dá)到峰值。然而，在NAC治療的小鼠組中，與沒(méi)有NAC治療的模型組相比，可以觀察到更弱的MSOT信號(hào)。此外，在探針HD-FL-4PEG9-N靜脈注射后不同時(shí)間小鼠的3D-MSOT圖像顯示在圖3F中。很明顯，與對(duì)照組（健康小鼠）或NAC治療組相比，模型組的腎臟顯示出更明顯的MSOT信號(hào)。顯然，這些MSOT成像數(shù)據(jù)與NIR-II熒光成像的結(jié)果一致。對(duì)每組主要器官進(jìn)行MSOT成像。從圖3G，H可以看出，在主要器官中，模型組腎臟中的MSOT信號(hào)強(qiáng)，證實(shí)了HD-FL-4PEG9-N分子主要進(jìn)入腎臟，可以通過(guò)響應(yīng)其中的NO來(lái)有效檢測(cè)AKI。模型組中的小鼠體重明顯下降，這進(jìn)一步證實(shí)了順鉑的毒性。這些結(jié)果證實(shí)了探針HD-FL-4PEG9-N確實(shí)可以在順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠中被NO有效原位激活，并且可以通過(guò)NIR-II熒光成像和MSOT成像實(shí)時(shí)評(píng)估AKI在小鼠中的嚴(yán)重程度和治療結(jié)果。

皮膚是抵御有害外力防線。因此，開(kāi)放性皮膚傷口極易受到細(xì)菌感染，因?yàn)樗鼈兛梢宰鳛椴≡w的入口。細(xì)菌感染的皮膚傷口中，一氧化氮 （NO） 過(guò)表達(dá)，可作為原位活化生物成像的內(nèi)源性生物標(biāo)志物。因此，為了評(píng)估探針HD-FL-4PEG9-N作為可噴霧探針的應(yīng)用，我們采用了細(xì)菌感染的皮膚傷口小鼠模型。細(xì)菌感染的皮膚傷口小鼠模型是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法建立的，該方法包括金黃色葡萄球菌的損傷、感染和細(xì)菌暴露程序，因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌（金黃色葡萄球菌，簡(jiǎn)稱金黃色葡萄球菌）是最主要的病原體之一，可引起廣泛的臨床表現(xiàn)，是所有常見(jiàn)葡萄球菌中最危險(xiǎn)的。實(shí)驗(yàn)過(guò)程如圖4A所示。通過(guò)將抗菌肽Tet213（KRWWKWWRRC）（Tet213）溶液涂在皮膚傷口部位（第1、2、3、4和5天）（治療組）來(lái)治療細(xì)菌感染的皮膚傷口。一組未經(jīng)任何治療的健康小鼠作為對(duì)照組。探頭HD-FL-4PEG9-N（2.0mg/kg）在第 3 天、第 7 天和第 12 天噴灑在皮膚傷口部位進(jìn)行體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)。如圖4B，G所示，在第7天，在探針噴灑到傷口部位30分鐘后，在模型組小鼠的傷口部位出現(xiàn)明顯的NIR-II熒光信號(hào)。相反，在對(duì)照組中，由于NO（健康小鼠）水平低，皮膚傷口部位的熒光可以忽略不計(jì)。在治療組（用Tet213治療的模型小鼠）中，與模型組相比，傷口部位的熒光信號(hào)要弱得多，表明治療后傷口部位的NO水平降低。此外，圖 S38–S41（支持信息）顯示了探針 HD-FL-4PEG9-N 噴灑到皮膚傷口部位后第 3 天或第 12 天記錄的 NIR-II 熒光圖像。接下來(lái)，對(duì)小鼠細(xì)菌感染的皮膚傷口進(jìn)行MSOT成像。圖 S42–S47（支持信息）顯示了在探針 HD-FL-4PEG9-N 原位噴灑在傷口部位后，在給定日期的不同時(shí)間點(diǎn)記錄的小鼠的橫截面 MSOT 圖像。在噴灑探頭后 30 分鐘，模型組的傷口部位出現(xiàn)明顯的 MSOT 信號(hào)。然而，對(duì)于治療組（用 Tet213 治療），傷口部位顯示很少的 MSOT 信號(hào);在對(duì)照組（健康小鼠）中，由于健康小鼠的NO水平較低，傷口部位的MSOT信號(hào)可以忽略不計(jì)。此外，在探針HD-FL-4PEG9-N噴灑在傷口部位后覆蓋傷口部位的3D-MSOT圖像如圖4C所示。很明顯，與治療組和對(duì)照組相比，在小鼠模型組的皮膚傷口部位可以觀察到更強(qiáng)的MSOT信號(hào)。這些MSOT成像數(shù)據(jù)與NIR-II熒光成像的結(jié)果一致。

結(jié)論：

總之，本研究設(shè)計(jì)了一種被稱為“具有外部水化層的同源二元體"的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)策略，用于設(shè)計(jì)具有長(zhǎng)吸收和發(fā)射波長(zhǎng)的花青染料。這種創(chuàng)新設(shè)計(jì)融合了結(jié)構(gòu)元素：a）在同源二元結(jié)構(gòu)中，兩個(gè)七次甲基花青通過(guò)相對(duì)靈活的連接體緊密靠近，這增強(qiáng)了多烯骨架的空間過(guò)度擁擠，從而阻礙了反應(yīng)劑的攻擊，從而提高化學(xué)穩(wěn)定性。這種布置還可以防止大范圍的??–??堆疊，從而避免吸收藍(lán)移并確保水介質(zhì)中的光譜穩(wěn)定性。b)四個(gè)親水性和生物相容性PEG9鏈戰(zhàn)略性地放置在末端雜環(huán)上，形成外部水化層。該層不僅具有優(yōu)異的水溶性和生物相容性，而且還顯著減輕了蛋白質(zhì)結(jié)合。這些組合特性可以顯著增強(qiáng)光學(xué)和化學(xué)性能。基于這種方法，開(kāi)發(fā)了一種生物標(biāo)志物響應(yīng)的NIR-II探針（HD-FL-4PEG9-N），它具有優(yōu)異的水溶性、良好的化學(xué)穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性和光學(xué)光譜穩(wěn)定性。該探針響應(yīng)生物標(biāo)志物NO，產(chǎn)生明顯的NIR-II熒光發(fā)射和光聲信號(hào)。探針HD-FL-4PEG9-N已成功用作注射探針來(lái)成像急性腎損傷，以及噴霧探針通過(guò)響應(yīng)原位生物標(biāo)志物NO來(lái)成像細(xì)菌感染的皮膚傷口。特別是，3DMSOT圖像有助于通過(guò)3D信息可視化疾病部位/大小。該策略有助于解決大共軛染料長(zhǎng)期面臨的固有問(wèn)題，從而釋放大共軛染料在生物應(yīng)用中NIR-II熒光成像和光聲成像的潛力。此外，該策略可以為設(shè)計(jì)用于各種生物應(yīng)用的其他大共軛生色團(tuán)提供見(jiàn)解。