腎功能障礙在最初階段的癥狀非常隱蔽，但后期可能導(dǎo)致腎功能不全、腎衰竭，甚至死亡。據(jù)估計，每年有300萬人患末期腎臟疾病，死亡數(shù)超過百萬。因此，早期實時監(jiān)測腎功能不全對開展保護(hù)性干預(yù)和預(yù)防腎臟疾病的發(fā)展具有重要價值。

通過第二近紅外（NIR-II）熒光成像可以實現(xiàn)體內(nèi)腎功能障礙的實時監(jiān)測，對腎臟疾病的診斷和維護(hù)患者健康具有重要意義。然而，目前開發(fā)的腎臟可清除NIR-II熒光材料的光穩(wěn)定性差、量子產(chǎn)率低、激發(fā)波長短（均位于NIR-I區(qū)域），導(dǎo)致相鄰生物組織中的背景信號高，腎臟成像的分辨率和信噪比低，限制了其在腎臟疾病研究中的應(yīng)用。開發(fā)具有優(yōu)異光物理性質(zhì)的新型腎清除NIR-II發(fā)光材料十分具有挑戰(zhàn)性，但在該領(lǐng)域有巨大價值。

本研究合成了具有NIR-II激發(fā)和發(fā)射雙重功能的腎透明金納米團(tuán)簇（gold nanoclusters, Au-NCs），具有深層組織穿透、高信號背景比和高量子產(chǎn)率等特點。這些優(yōu)點使Au-NCs能夠?qū)崿F(xiàn)高分辨率熒光成像，以及監(jiān)測腎缺血再灌注（Renal Ischemia Reperfusion, RIR）和單側(cè)輸尿管梗阻（Unilateral Uretera Obstruction, UUO）引起的腎功能障礙（方案1）。本研究為NIR-II熒光成像提供了新的候選材料，并為腎臟疾病的高分辨率和精確成像提供了有力的工具。

方案1. 雙配體穩(wěn)定的Au NCs的示意圖和NIR-II窗口中腎臟功能障礙的熒光成像監(jiān)測。

在本研究中，通過兩步反應(yīng)在水相中合成了一系列雙配體穩(wěn)定的Au NCs。Au-配體復(fù)合物是通過將HAuCl4與MHA和另一種配體（包括Cystm、ME、DTT）混合，并在堿性條件下用NaBH4還原而形成的。透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示，雙配體穩(wěn)定的Au NCs是具有良好單分散性的超小球形顆粒（圖1a-d）。雙配體Au NCs與單配體MHA-Au NCs的吸收和發(fā)射光譜存在明顯差異，雙配體Au NCs在1000nm附近顯示出明顯的吸收峰（圖1e）；其NIR-II發(fā)光相較于單配體MHA-Au NCs增強了近16倍（圖1f-g）。使用NIR-II熒光染料IR-26作為參考，計算得MHA/Cystm-Au NCs、MHA/ME-Au NCs和MHA/DTT-Au NCs的QY分別為1.4%、2.0%和1.7%，明顯高于先前開發(fā)的腎可清除NIR-II熒光材料的值，說明Au-NCs作為腎透明熒光材料在生物成像應(yīng)用中具有潛力。

圖1. NIR-II熒光圖像、TEM圖像和所制備的MHA-Au NCs（a）、MHA/Cystm-Au NCs（b）、MHA/ME-Au NCs（c）和MHA/DTT-Au NCs（d）的尺寸分布。（e）Au NCs的紫外-可見-近紅外吸收光譜。（f）Au NCs的熒光發(fā)射光譜。（g）Au NCs的發(fā)光強度的比較。

作者以MHA/Cystm-Au NCs為模型，在水中使用1% Intralipid模擬生物軟組織進(jìn)行成像，進(jìn)一步評估了它們的NIR-II熒光成像的穿透深度、分辨率和SBR。發(fā)現(xiàn)穿透深度隨著激發(fā)波長增加而增加（圖2a），1064nm激發(fā)下檢測到的熒光信號高于980和808 nm激發(fā)下的熒光信號，且熒光強度因材料厚度增加而降低的程度明顯更?。▓D2b-c）。隨著激光和濾光片波長的增加，SBR不斷增加，毛細(xì)管半峰全寬逐漸減小（圖2d，e）。這些結(jié)果表明，采用長波長激發(fā)可以提高NIR-II成像的穿透深度、分辨率和SBR，也進(jìn)一步證明了雙配體穩(wěn)定的Au NCs用于生物成像的潛力。

圖2. （a）在不同激發(fā)（808、980和1064nm）下，用浸入1% Intralipid中的MHA/Cystm-Au NCs溶液填充的毛細(xì)管的熒光圖像。（b）來自（a）的沿著黃色箭頭的橫截面熒光強度分布。（c）MHA/Cystm-Au NCs在不同厚度（3、5和7mm）的Intralipid和不同激發(fā)激光下的熒光信號強度。（d）用不同的激發(fā)激光器和過濾器（2mm 1% Intralipid下）對填充有MHA/Cystm-Au NCs溶液的毛細(xì)管進(jìn)行NIR-II熒光成像。（e）截面熒光強度分布圖（黑色）和沿（d）中黃線的高斯擬合線（紅色）。

接著作者進(jìn)行了體內(nèi)熒光成像研究，通過小鼠尾靜脈注射ICG、MHA-Au NCs和雙配體Au NCs，在1064nm的激發(fā)下于NIR-II窗口中成像，探究所合成的Au NCs在腎臟中的成像性能。如圖3a所示，注射MHA/Cystm-Au NCs后5分鐘，腎臟即被清晰區(qū)分，并且沒有觀察到來自鄰近組織的明顯干擾信號。隨著MHA/Cystm-Au NCs從腎臟中清除，腎臟區(qū)域的熒光強度逐漸降低，接著Au NCs通過輸尿管進(jìn)入膀胱，在10分鐘時可觀察到膀胱區(qū)域的熒光信號，并在注射后3小時達(dá)到max值。隨后，Au NCs隨尿液排出體外。值得注意的是，MHA/Cystm-Au NCs的腎臟成像分辨率遠(yuǎn)高于先前文獻(xiàn)中報道的分辨率，腎臟區(qū)域的SBR高達(dá)4.53（圖3b-c）。與MHA/Cystm Au NC相比，ICG和其他Au NCs對腎臟的成像能力相對較弱，SBR值相對較低。這證明了MHA/Cystm-Au NCs具有良好的腎臟成像能力。

圖3.（a）靜脈注射MHA/Cysm-Au NCs后24小時內(nèi)KM小鼠的NIR-II熒光成像。（b）分別在靜脈注射MHA/Cysm-Au NCs、MHA/ME-Au NC、MHA/DTT-Au NCs、ICG和MHA-Au NCs后5分鐘KM小鼠的NIR-II熒光成像。（c）來自（b）的沿著黃線的橫截面熒光強度分布（黑色）和高斯擬合線（紅色）。

在上述研究的基礎(chǔ)上，作者使用MHA/Cystm-Au NCs分別對RIR和UUO誘導(dǎo)的腎功能障礙進(jìn)行成像，以評估其實際應(yīng)用能力。

RIR是腎臟疾病手術(shù)中的一種常見現(xiàn)象，容易導(dǎo)致急性腎損傷，并有發(fā)展為終末期腎臟疾病、帶來高死亡率的風(fēng)險。作者通過手術(shù)夾閉小鼠腎動脈和靜脈建立RIR小鼠模型。將兩個實驗組小鼠的左腎分別夾緊30和60分鐘；假手術(shù)組在沒有夾腎的情況下進(jìn)行了相同的手術(shù)，然后在術(shù)后15分鐘靜脈注射MHA/Cystm-Au NCs，在注射后的不同時間點對小鼠進(jìn)行成像（圖4a）。成像結(jié)果如圖4b所示。在假手術(shù)組小鼠中，左腎和右腎的熒光強度相當(dāng)，并具有相同的衰減趨勢（圖4c-d）；對于缺血30分鐘的小鼠，左腎的熒光強度在5分鐘內(nèi)增加到峰值，然后降低，下降的速度比假手術(shù)組慢，左腎和右腎的熒光強度比逐漸增加到1.3，這是由于缺血引起的左腎損傷，導(dǎo)致腎臟清除緩慢；對于缺血60分鐘的小鼠，左腎的熒光強度在注射后10分鐘達(dá)到max值，隨后降低，與缺血30分鐘相比，熒光強度下降的速度更慢，左腎與右腎的熒光強度比逐漸增加到2.2，表明缺血腎的清除率進(jìn)一步減慢。這些結(jié)果表明，腎缺血時間越長，腎臟在注射Au NCs后達(dá)到m熒光的時間越長以及左腎和右腎的熒光之間的差異越大。隨著成像時間的增加，缺血性腎臟的SBR逐漸高于非缺血性腎臟（圖4e）。

圖4. （a）RIR小鼠模型的構(gòu)建和RIR小鼠NIR-II熒光成像的時間線的示意圖。（b）靜脈注射MHA/Cystm-Au NCs后RIR小鼠在不同時間點的NIR-II熒光成像。（c） 注射MHA/Cystm-Au NCs后缺血腎臟熒光強度的變化（*p＜0.05，**p＜0.01）。（d）RIR小鼠左腎和右腎的熒光強度比。（e）SBR用于靜脈注射MHA/Cystm-Au NCs后不同時間點RIR小鼠缺血性腎臟的熒光成像。

UUO法常用于腎間質(zhì)纖維化模型的制備。梗阻后，尿液潴留壓迫腎小管，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行性壞死，間質(zhì)急慢性炎細(xì)胞浸潤，壞死的腎小管組織逐漸被纖維瘢痕取代，最終形成進(jìn)行性腎間質(zhì)纖維化。作者通過外科縫線完quan結(jié)扎小鼠左輸尿管建立UUO模型。結(jié)扎一段時間后，將MHA/Cystm-Au NCs靜脈注射到小鼠中，并在注射后的不同時間點進(jìn)行NIR-II熒光成像（圖5a）。如圖5b所示，在注射后5分鐘檢測到腎臟中的NIR-II發(fā)光信號，并隨著時間的推移逐漸減弱。在接受輸尿管結(jié)扎0分鐘和30分鐘的小鼠中，左腎和右腎的信號之間沒有觀察到明顯的差異；在接受輸尿管結(jié)扎24小時的小鼠中，左腎的熒光顯著低于右腎（圖5c），且左腎的SBR低于右腎的SBR（圖5d）。表明輸尿管結(jié)扎24小時會導(dǎo)致腎濾過異常，結(jié)扎30分鐘則無顯著影響。

此外，作者還對兩組模型分別進(jìn)行了H&E染色分析驗證腎損傷情況。結(jié)果顯示，使用UUO模型的實驗中，與假手術(shù)組的腎臟相比，UUO 24小時后，腎臟腎小管輕度擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞少量壞死脫落，證實了UUO 24 小時誘導(dǎo)的輕微腎損傷。而在使用RIR誘導(dǎo)的腎損傷模型的實驗中，與未缺血的小鼠相比，缺血60min的小鼠的腎臟結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了一些明顯的損傷，表明60min的夾閉導(dǎo)致了嚴(yán)重的腎損傷。該結(jié)果與熒光成像結(jié)果一致，因為缺血60分鐘的小鼠觀察到蕞高熒光信號的時間晚于UUO 24小時的小鼠（圖4b, 5b）。這說明所制備的Au-NCs能夠區(qū)分不同的腎損傷情況，驗證了Au-NCs對腎功能障礙成像的能力。

圖5. （a）UUO小鼠模型的建立和NIR-II熒光成像的示意圖。（b）輸尿管結(jié)扎0分鐘、30分鐘和24小時的UUO小鼠靜脈注射MHA/Cystm-Au NCs后的NIR-II熒光成像。（c）沿圖中黃線的橫截面熒光強度圖。（d）注射MHA/Cystm-Au NCs后5分鐘，不同結(jié)扎時間的UUO小鼠腎臟熒光成像的SBR。

總之，本研究成功合成了一系列具有NIR-II激發(fā)和發(fā)射的雙配體穩(wěn)定的Au NCs，可用于體內(nèi)RIR和UUO誘導(dǎo)的腎功能障礙的高分辨率熒光成像。與以往的腎功能NIR-II成像相比，在NIR-II激發(fā)下的熒光成像可以更清晰地顯示腎臟，實現(xiàn)對腎功能障礙的更準(zhǔn)確診斷，為腎功能障礙的高分辨率精確成像提供了有力的工具。

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