本文要點：作者構(gòu)建了一種簡單但有用的D-A型線粒體靶向近紅外二區(qū)熒光團(tuán)（MTF）。這種線粒體靶向染料MTF不僅表現(xiàn)光熱效應(yīng)，而且具有光動治療效果。被DSPE-mPEG包裹成納米粒后，實現(xiàn)高腫瘤特異性靶向，可以用于NIR-Ⅱ熒光引導(dǎo)的光動力學(xué)治療（photodynamic therapy PDT）和光熱力學(xué)治療（photothermal therapy PTT）。

各種各樣的NIR-Ⅱ染料幾乎都是基于D-A-D型的對稱熒光團(tuán)或多次甲基熒光團(tuán)。作者希望探索具有優(yōu)異性能的獨te小分子NIR-Ⅱ探針，成為癌癥治療臨床應(yīng)用的候選對象。光動力治療和光熱治療是廣泛應(yīng)用于癌癥治療的新型療法。PDT中，光敏劑（PS）在光照條件下產(chǎn)生氧自由基從而殺死腫瘤細(xì)胞。盡管PDT因其時空控制、無入侵性和良好的選擇性而被視為治療許多惡性腫瘤的有力工具，但是臨床應(yīng)用的卟啉、酞菁及其類似物等光敏劑通常處于可見及紫外區(qū)，阻止其在深部腫瘤治療中的應(yīng)用。PTT中，高光熱轉(zhuǎn)換效率的材料把光轉(zhuǎn)換成熱量從而殺死腫瘤細(xì)胞。然而熱休克蛋白HSP會在PTT過程中產(chǎn)生，降低治療效果。因此開發(fā)一種新的NIR-Ⅱ探針，實現(xiàn)更深的穿透深度成像、更高分辨率并將PDT和PTT結(jié)合起來可獲得更好的治療效果。

MTF在沒有任何配基修飾下實現(xiàn)了線粒體靶向能力，在NIR-Ⅱ（~1015nm）表現(xiàn)出優(yōu)異的熒光發(fā)射能力。為進(jìn)一步提高體內(nèi)的適用性，使用DSPE-PEG2000通過納米沉淀法封裝MTF，得到MTF納米點。研究了MTF和MTF納米點的光學(xué)性能、光動力學(xué)、光熱力學(xué)性能以及抗腫瘤能力。它們表現(xiàn)出較好的NIR-Ⅱ腫瘤靶向性和深層組織穿透性，能夠?qū)崿F(xiàn)實時NIR-Ⅱ熒光成像。

結(jié)論

圖1

圖1a表示MTF探針的合成路線，反應(yīng)物1通過邁克爾加成得到2。經(jīng)過硫代乙酸和san氟化硼醚處理，反應(yīng)物2轉(zhuǎn)化成為關(guān)鍵中間體硫代吡啶鎓3。再通過Knoevenagel縮合，與4形成MTF。Maldi-Tof等表征手段證明了MTF的成功制備。如圖1b作者測量了DCM為溶劑的MTF光學(xué)性質(zhì)。MTF具有中心714 nm的強近紅外吸收，有三個發(fā)射峰：一個在近紅外一區(qū)（420 nm激發(fā)），另外兩個在近紅外二區(qū)（808 nm激發(fā)）。如圖1c，在DCM溶劑中，NIR-Ⅱ的兩個發(fā)射帶分別位于~918 nm、~1015 nm。這可能因為溶劑吸收以及扭曲的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)（TICT）。在不同厚度的雞胸組織上進(jìn)行MTF輔助NIR-Ⅱ熒光成像的穿深能力測試。NIR-Ⅱ熒光強度與雞胸厚度成反比。當(dāng)厚度達(dá)到8 mm時，仍然可見微弱的MTF NIR-Ⅱ熒光信號。表明設(shè)計的MTF可以用于NIR-Ⅱ成像引導(dǎo)的光治療。

圖2

作者隨后研究了MTF暴露在808nm激光（1W·cmˉ2）下的光動力學(xué)表現(xiàn)。首先用1,3-二苯基異苯并呋喃（DPBF）作為檢測探針來評估活性氧ROS的產(chǎn)生。通過檢測DPBF在415nm的吸光度下降來記錄MTF的ROS產(chǎn)生能力。如圖2b，在808nm光激發(fā)下，在MTF存在下，觀察到DPBF吸光度明顯下降，對照組（DPBF+激光）的DPBF吸光度降低可以忽略不計（圖2a），這說明MTF優(yōu)異的ROS產(chǎn)生能力，并使用ICG作為參考，功率密度1W·cmˉ2的808nm激光激發(fā)下，在DMF中測量MTF的ROS產(chǎn)生效率為0.34。此外，使用2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）在小鼠癌癥4T1細(xì)胞中測量體外ROS的產(chǎn)生。DCFH-DA可被胞漿酯酶脫乙?；癁榉菬晒饣衔?，隨后被ROS氧化為2’,7’-二氯熒光素（DCF），從而發(fā)射綠色熒光信號。如圖2d，用40 nM MTF、808 nm激光輻射（0.5W·cmˉ2）處理細(xì)胞，清楚觀察到細(xì)胞內(nèi)ROS信號。此外，作者還得MTF的光熱效應(yīng)進(jìn)行了體外評價。如圖2e、f，當(dāng)暴露于808nm激光照射下，80 mM和100 mM MTF表現(xiàn)出顯著的升溫，但是純水沒有，這說明其具有很好地光熱活性。之后，對其進(jìn)行多次加熱冷卻循環(huán)，觀察到墜高溫度略有下降。之后，通過CCK-8測定法測定體外細(xì)胞毒性，MTF在沒有激光照射下對4T1細(xì)胞不表現(xiàn)出明顯細(xì)胞毒性，但是如圖2c所示，在808 nm激光（0.5W·cmˉ2）激發(fā)下，細(xì)胞活力隨著濃度增大而降低。特別的是，用40 nM MTF在808 nm激發(fā)下處理細(xì)胞，大約78%的細(xì)胞被破壞。40 mM MTF對4T1細(xì)胞表現(xiàn)輕微的毒性，這可能因為MTF的正電荷。此外，用鈣黃綠素AM/PI染色法測量活細(xì)胞，808 nm激光照射下，4T1細(xì)胞被染成明顯的紅色熒光，但是另外兩組“PBS+激光"、“MTF"表現(xiàn)出明顯的綠色熒光。這些結(jié)果說明了MTF對癌細(xì)胞優(yōu)異的PDT、PTT活性。圖2g通過MitoTracker Red在4T1細(xì)胞的共定位實驗證明了MTF的線粒體靶向能力。

圖3

作者隨后研究了體內(nèi)MTF的表現(xiàn)。如圖3a，作者構(gòu)建了MTF與DSPE-PEG2000的納米點，從而提高生物相容性和可行性。如圖3b，TEM下觀察到MTF點呈現(xiàn)均勻的球形，平均尺寸72±18nm；通過動態(tài)光散射（DLS）確定流體動力學(xué)直徑為89±14nm。MTF點的zeta勢確定為0.8mV，說明膠束表面具有正表面電荷。如圖3c，在去離子水測量MTF的光譜性質(zhì)，吸收峰位于~785 nm，在NIR-II有兩個發(fā)射峰，一個在~920 nm，一個~1040 nm（808 nm激發(fā)），與MTF相似。所以納米封裝不影響MTF的光物理性質(zhì)。在808 nm激發(fā)下，使用IR-26（QY=0.5%）作為參比，水溶液中測量MTF點的NIR-Ⅱ量子產(chǎn)率為0.512%。之后研究了MTF點的光熱、光動力學(xué)性能：808 nm照射下，含有MTF點的DPBF在415 nm處的吸光度顯著降低，并且使用ICG作為參比，計算出水溶液中ROS產(chǎn)生速率約為0.026.此外在含有10% PBS的水溶液中和DMEM介質(zhì)中，MTF點的平均尺寸在15天內(nèi)保持不變，說明MTF點的高穩(wěn)定性。在808 nm激光照射下，與ICG相比，MTF點在水中表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性。此外，MTF點表現(xiàn)出與MTF相同的光熱活性。計算出來的光熱轉(zhuǎn)化效率為~0.39。用體外線粒體共定位實驗說明了MTF點具有良好的線粒體靶向能力，這表明MTF點可以用于體內(nèi)NIR-Ⅱ成像引導(dǎo)PDT、PTT。

圖4

如圖4a，在皮下4T1荷瘤Balb/c小鼠評估體內(nèi)MTF點的NIR-Ⅱ熒光成像。靜脈注射200 mg后的6、12、24、36、48小時，在腫瘤部位觀察到明顯的熒光信號。信號從注射后12 h開始逐漸增加。腫瘤熒光強度在24-60 h內(nèi)與其他組織顯著不同，在48 h達(dá)到墜大值。之后解剖小鼠觀察臟器分布。肝臟和脾臟表現(xiàn)出墜強的NIR-Ⅱ信號，其次是腫瘤，表明了肝膽清除途徑。如圖4b、c，注射MTF點48 h后將腫瘤暴露在808 nm激光下連續(xù)6 min，溫度在6 min內(nèi)升高至接近55 ℃，說明了高效的光熱活性。如圖4d、e，測量4T1腫瘤小鼠在是否注射MTF的體重和腫瘤體積。如圖4f、g，治療22天后，與其他三組相比， “MTF點+激光"組的腫瘤受到顯著抑制。體外腫瘤組織的H&E染色顯示，808 nm+MTF點處理時，腫瘤細(xì)胞明顯被破壞。所有組H&E染色的主要器官都沒有觀察到炎癥病變。此外，主要血細(xì)胞也在正常范圍內(nèi)。所有結(jié)果說明，MTF點可以作為一種有效的PDT、PTT抗腫瘤藥物，沒有明顯的副作用。

總結(jié)

作者構(gòu)建的新型NIR-Ⅱ有機分子MTF具有如下幾個優(yōu)勢：在NIR-Ⅰ和NIR-Ⅱ有強的熒光；可以在沒有靶向配基下進(jìn)行線粒體成像，并且具有顯著的PDT、PTT療效；MTF與DSPE-PEG2000形成納米點從而診斷和治療4T1腫瘤。

參考文獻(xiàn)

Ding, Qihang, Ling Mei, Yu Liu, Shan Zhou, Lu Chen, Yuying Liang, Mingle Li, Hui Zhou, Y. I. N. Chao, and Jong Seung Kim. "Mitochondria-targeted Fluorophores for in vivo NIR-II Imaging-guided PDT/PTT."Chemical Communications (2023).

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