本文要點：光聲成像(PAI)/第二近紅外窗口熒光成像(NIR-II FI)雙模式成像技術(shù)由于具有較高的空間分辨率和信噪比，在檢測腫瘤組織和前哨淋巴結(jié)(SLN)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究以苯并噻二唑為電子受體，開發(fā)了兩種聚集誘導(dǎo)發(fā)光劑(AIEgens)(C-NTBD和O-NTBD)，首ci將PAI/NIR-Ⅱ FI應(yīng)用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(NENs)及其SLNs的診斷和治療。其中，C-NTBD納米粒子具有較好的PAI和NIR-II熒光性能，其zui大吸收波長位于732 nm，發(fā)射峰位于1042 nm。在荷NENs裸鼠模型中，在PAI術(shù)前成功定位NENs后，再用NIR-II FI檢測SLN。在C-NTBD納米粒子的NIR-II FI引導(dǎo)下，發(fā)現(xiàn)并精確地切除了位于胸壁的遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤部位的直徑為1 mm的SLN。

背景：神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(NENs)是一組起源于肽能神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。現(xiàn)代影像技術(shù)仍然無法準(zhǔn)確識別微小的NENs病變組織和SLNs(毫米級)。為了克服單一成像模式的不足，多模式成像技術(shù)被開發(fā)出來，以綜合兩種或兩種以上成像模式的優(yōu)點。由于PAI的高空間分辨率和NIR-II FI的高信噪比的優(yōu)勢互補，PAI/NIR-II FI雙模態(tài)成像技術(shù)在腫瘤組織和SLNs的檢測中顯示出巨大的應(yīng)用前景。術(shù)前PAI成功定位腫瘤組織后，術(shù)中NIR-II FL可準(zhǔn)確檢測SLNs，預(yù)防性剝離SLNs，降低腫瘤殘留率。然而，在以往的研究中，PAI/NIR-II FI主要應(yīng)用于腫瘤的診斷，而其在腫瘤和SLN診斷中的應(yīng)用研究較少。

研究內(nèi)容：本研究以苯并噻二唑為電子受體，開發(fā)了兩種聚集誘導(dǎo)發(fā)光劑(AIEgens)(C-NTBD和O-NTBD)，首ci將PAI/NIR-Ⅱ FI應(yīng)用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(NENs)及其SLNs的診斷和治療。其中，C-NTBD納米粒子具有較好的PAI和NIR-II熒光性能，其zui大吸收波長位于732 nm，發(fā)射峰位于1042 nm，血管造影分辨率高達(dá)20μm。在C-NTBD納米粒子的實時NIR-II FL引導(dǎo)下，發(fā)現(xiàn)并精確地切除了位于胸壁的遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤部位的直徑為1 mm的SLN。這種雙模態(tài)成像技術(shù)可以提高術(shù)中切除SLNs的準(zhǔn)確性，改善患者的預(yù)后，為準(zhǔn)確治療NENs提供新的策略。(Scheme 1)

首先，作者進(jìn)行了分子設(shè)計和合成，然后進(jìn)行了理論計算。為了探索更多的C-NTBD和O-NTBD的結(jié)構(gòu)信息，用Gaussian 09 W程序，用B3LYP/6-31G*基組模擬了它們的分子優(yōu)化結(jié)構(gòu)和分子軌道能級信息。C-NTBD和O-NTBD都表現(xiàn)出扭曲的立體結(jié)構(gòu)，這可以有效地防止聚集態(tài)的堆積(例如，π-π堆積)。C-NTBD和O-NTBD在π電子傳遞單元和電子受體苯并噻二唑之間的二面角分別為48.1?和38.7?(圖1B)。C-NTBD的分子結(jié)構(gòu)比O-NTBD更扭曲，這更有利于分子激發(fā)態(tài)能量通過輻射途徑耗散。如圖1C所示，C-NTBD和O-NTBD的zui低未占分子軌道(LUMO)電子密度都主要集中在苯并噻二唑部分，而它們的zui高占據(jù)分子軌道(HOMO)的軌道能級沿分子骨架均勻分布。

Figure 1

然后作者研究了C-NTBD和O-NTBD的光物理性質(zhì)。C-NTBD的吸收峰和摩爾消光系數(shù)(ε)如圖2a所示。O-NTBD與C-NTBD相比吸收峰紅移，因為烷氧基比乙基具有更強的供電子能力，這一結(jié)果與激發(fā)態(tài)計算相一致。作者還研究了聚集態(tài)分子的吸收性能。將9倍體積的水加入到DMSO溶液中(水的分?jǐn)?shù)為90%)，制備了分子聚集體。如圖2B所示，C-NTBD在聚集體中的吸收峰移動到了746 nm，O-NTBD在聚集體中的吸收峰也發(fā)生了移動(795 nm)。C-NTBD在808 nm處的ε比O-NTBD在溶液和聚集態(tài)下的高，這有利于C-NTBD更多地吸收光能，轉(zhuǎn)化為近紅外-II熒光和熱。作者使用靈敏度更高的近紅外成像系統(tǒng)(1000nm LP濾光片)來測定C-NTBD和O-NTBD的ΦPL。如圖2C所示，O-NTBD的ΦPL為0.83%，而C-NTBD的ΦPL為0.22%。作者還測量了它們在不同比例的DMSO/甲苯體系中的光致發(fā)光強度。這兩個分子都顯示出典型的AIE特征，因為熒光強度隨著甲苯組份(Ftol)的增加而增加(圖2D)。

Figure 2

接下來，作者對C-NTBD和O-NTBD進(jìn)行PEG化修飾(圖3A)得到C-NTBD NPs和O-NTBD NPs，并對其進(jìn)行表征。動態(tài)光散射(DLS)結(jié)果表明，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs平均流體動力學(xué)直徑分別為142.49 nm和129.34 nm(圖3B)。TEM結(jié)果表明，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs具有均勻的球形結(jié)構(gòu)，平均直徑分別為139 nm和111 nm(圖3B)。與C-NTBD NPs相比，O-NTBD NPs的zui大吸收波長(776 nm比732 nm)和發(fā)射峰(1110 nm比1042 nm)顯著紅移(圖3C)。在808 nm激光激發(fā)和1000 nm LP濾光片上，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs都顯示出顯著的熒光信號，其中C-NTBD NPs發(fā)射出更強的熒光信號(圖3D)。C-NTBD NPs在9 mm雞胸肉覆蓋下顯示出明顯的NIR-II熒光信號，而O-NTBD NPs在6 mm雞胸組織覆蓋度下的熒光信號非常微弱(圖3D)。這些結(jié)果表明，與O-NTBD NPs相比，C-NTBD NPs的NIR-II成像能力更好。

Figure 3

隨后，作者用熱成像儀研究了C-NTBD納米顆粒和O-NTBD納米顆粒在不同濃度下隨808 nm激光照射時間的溫度變化，進(jìn)一步評價了它們的光熱轉(zhuǎn)化性能(圖4a和圖4b)。在808 nm激光(0.5W/cm2)照射下，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs的溫度都迅速上升，并在激光照射5分鐘后達(dá)到穩(wěn)定水平(圖4a&b)。C-NTBD納米粒子和O-NTBD納米粒子表現(xiàn)出濃度依賴的光熱效應(yīng)。C-NTBD納米顆粒表現(xiàn)出比O-NTBD納米顆粒更好的光熱性能(5min的ΔTmax分別為49.8?C和43.6?C)(圖4C)。此外，C-NTBD納米顆粒和O-NTBD納米顆粒的光熱性能在5次加熱-冷卻循環(huán)后保持不變，證實了它們良好的光熱穩(wěn)定性(圖4D)。

Figure 4

作者進(jìn)一步研究了它們的PA性質(zhì)。C-NTBD NPs和O-NTBD NPs分別在755 nm和785 nm的激光波長下獲得了zui大的PA強度。在760 nm激光照射下，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs的PA信號都隨著AIEgens濃度的增加而增強，并在3.125-100μM的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系(圖5a和b)。C-NTBD納米粒子在體外表現(xiàn)出比O-NTBD納米粒子更好的PAI性能，這與其光熱性能是一致的。如圖5C所示，在給藥C-NTBD NPs(0 h)之前，腫瘤部位有微弱的PA信號。靜脈注射C-NTBD NPs后8h達(dá)到zui大值，提示注射后8h是STC NENs進(jìn)行PAI的zui 嘉時間點(圖5C和圖5D)。這些結(jié)果證實C-NTBD NPs可作為NENs的有效的高對比度PAI探針。

Figure 5

作者還通過靜脈注射在BALB/c裸鼠大腦皮層血管中進(jìn)一步評估了C-NTBD NPs用于NIR-II FI的體內(nèi)性能。如圖6A所示，靜脈注射C-NTBD NPs 5分鐘后，大腦皮質(zhì)血管顯示明亮的近紅外-II熒光信號(由1000 nm LP濾光片采集)，成像深度為300μm，清楚地顯示了大腦皮質(zhì)豐富的血管網(wǎng)絡(luò)。為了進(jìn)一步評估血管成像的分辨率，選擇其中一個大腦皮層區(qū)域進(jìn)行放大研究(圖6B)。大腦皮質(zhì)微血管的熒光信號仍然清晰明亮，分辨率高(20μm)(圖6D)。這些結(jié)果證明了C-NTBD納米粒在體內(nèi)具有顯著的NIR-II熒光能力。

Figure 6

最后作者在體內(nèi)NIR-II FI引導(dǎo)下對荷瘤裸鼠模型進(jìn)行了SLNs手術(shù)。瘤內(nèi)注射C-NTBD NPs后，用NIR-II實時成像系統(tǒng)(808 nm激光激發(fā)，1000 nm LP濾光片)對荷瘤裸鼠全身進(jìn)行成像。注射后1分鐘，除腫瘤部位可見明亮信號外，SLN的信號以及兩者之間的淋巴引流信號也隱約可見(圖7B)。值得注意的是，其中一個SLN位于胸壁，遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤部位，在常規(guī)SLN解剖中極易被忽視。15分鐘后(圖7C)，鄰近SLN、遠(yuǎn)端胸壁SLN的信號及兩者之間的淋巴引流信號更加明顯，在注射后1h內(nèi)，信號強度隨時間增加(圖7D)。然后，作者在已建立的NENs模型中實施NIR-II FI引導(dǎo)下的SLNs手術(shù)。首先切除SLNs區(qū)域的表皮，然后再次進(jìn)行NIR-II FI。與去除表皮前相比，SLNs信號亮度增加(圖7e和f)，表明外科手術(shù)位置是準(zhǔn)確的。隨后，在NIR - II熒光信號的引導(dǎo)下，SLN被精確地移除(圖7g )。手術(shù)時間約為10分鐘，分離淋巴結(jié)的大小約為1mm(圖7h和i)。切除腫瘤和SLN后進(jìn)行H&E和免疫組織化學(xué)(IHC)染色，以確認(rèn)切除的腫瘤是NENs及其SLN(圖7j-o )。

Figure 7

總結(jié)：作者設(shè)計和合成了兩種以苯并噻二唑為電子受體的NIR-II類發(fā)光試劑(C-NTBD和O-NTBD)。為了使疏水的C-NTBD和O-NTBD具有良好的水分散性，采用納米沉淀法制備了C-NTBD NPs和O-NTBD NPs 。體外研究表明，與O-NTBD NPs相比，C-NTBD NPs具有更好的光熱、PAI和NIR-II FI性能。以C-NTBD NPs為造影劑，首ci將PAI/NIR-II FI應(yīng)用于神jing，病變組織和SLN的識別和治療。在C-NTBD納米粒子的實時NIR-II FL引導(dǎo)下，甚至發(fā)現(xiàn)并精確地切除了位于胸壁的遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤部位的1 mm SLN。這項工作為NENs的臨床治療提供了一種很有前景的方法。

參考文獻(xiàn)

doi.org/10.1016/j.biomaterials.2022.121780

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