本文要點：第二近紅外（NIR-II）窗口中缺乏具有高量子產率（QYs）和低肝保留的有機熒光團已成為生物成像領域的瓶頸。本文提出通過將磷酸化熒光染料包封到可生物降解的磷酸鈣納米顆粒中來解決這些問題。首先，NIR-II分子LJ-2P通過引入兩個磷酸基團來增加水溶性。同時，LJ-2P與鈣離子共沉淀，形成LJ-2P納米顆粒（NPs）。與LJ-2P相比，LJ-2P NPs在水溶液中的QYs增加了36.57倍，達到5.12%。這種獨te的現(xiàn)象被稱為沉淀增強發(fā)射（PEE），其詳細機制通過飛秒瞬態(tài)吸收進行探索。結果表明，LJ-2P與鈣離子的共沉淀改變了微環(huán)境，限制了分子的旋轉并減少了水分子的相互作用，特別是激發(fā)態(tài)質子轉移。此外，由于對pH敏感，80%以上的LJ-2P NPs24小時內在肝臟被代謝?；趦?yōu)異的光學性能和良好的生物相容性，實現(xiàn)了高對比度的血管可視化和乳腺腫瘤檢測。該策略可應用于其他NIR-II熒光團，以實現(xiàn)高QYs和低肝臟保留。

背景：截止到目前，已經報道了一系列開發(fā)高亮度NIR-II熒光團的策略。例如，將熒光團與胎牛血清(FBS)結合形成穩(wěn)定的蛋白質-熒光團復合體。由于熒光團分子內旋轉受限，以及熒光團核心與周圍水分子間相互作用減弱，復合物的QYs通常高于單獨的熒光團。用聚集誘導發(fā)射(AIE)基團修飾熒光團也是改善極性溶劑中QYs的有效方法。其他策略如抑制激發(fā)態(tài)的扭曲分子內電荷轉移(TICT)，扭曲共軛骨架，以及引入剛性結構也已被報道。雖然這些策略顯示了良好的效果，但在臨床應用中仍存在一些問題，如FBS成分復雜或AIE等分子在肝臟中嚴重積累。因此，本文合理設計了一種具有兩個磷酸基的D-A-D分子LJ-2P。LJ-2P的磷酸鹽基團與鈣離子共沉淀形成LJ-2P NPs。一方面，沉淀產生的微環(huán)境限制了分子運動和分子內旋轉，提高了QYs。另一方面，LJ-2P NPs在LJ-2P分子周圍形成空腔，有效減少了核骨架與水分子的相互作用。此外，通過引入兩個磷酸鹽基團，提高了分子在水中的溶解度。水溶性分子被包封在對pH敏感的LJ-2P NPs中，以改善其在肝臟中的長期積累。總之，我們的PEE策略不僅改善了QYs，而且提高了體內生物相容性。

研究內容：我們選擇了具有較高化學穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性的苯并[1,2-c:4,5-c’]雙([1,2,5]噻二唑)(BBTD)衍生物作為模型分子。如Figure.1A所示，LJ-2P是從市面上可用的起始材料按照9步路線合成的。這條路線包括了傅克?；外從九悸?lián)反應等關鍵的反應。由于BBTD核心在堿性條件下容易分解，因此選擇了氯氧磷進行磷酸化。用氯氧磷成功地將兩個磷酸基引入熒光團中，得到理想產物LJ-2P，不僅提高了水溶性，而且為實現(xiàn)PEE奠定了基礎。在B3LYP /6-31G(d)水平上使用高斯09程序進行密度泛函理論(DFT)計算，得到LJ-2P分子的zui高占據(jù)分子軌道(HOMO)和zui低未占分子軌道（Figure.1B）。HOMO在芴和BBTD單元上離域，而LUMO主要定位在缺電子的BBTD單元上。帶隙為1.56 eV，窄帶隙有利于NIR-II窗口的強吸收。

Figure 1

采用反向微乳液法構建具有高亮度和良好生物相容性的LJ-2P NPs（Figure.2A）。將溶解在Na2HPO4溶液中的LJ-2P分散在環(huán)己烷/聚氧代乙烯 (5)壬基苯基醚中形成P相。將CaCl2溶液分散在環(huán)己烷/聚氧代乙烯（5）壬基苯基醚中形成Ca相。然后將P相加入到Ca相中形成無定形的CaP沉淀，再用二油酰磷脂酸鈉鹽（DOPA）穩(wěn)定得到LJ-2P NPs核心。透射電子顯微鏡(TEM)顯示，LJ-2P NPs核心的平均直徑為≈5 nm，而動態(tài)光散射(DLS)分析測得的尺寸因水化半徑而略大(≈9 nm，F(xiàn)igure.2B)。進一步用DSPE-mPEG2000對LJ-2P核粒子進行封裝，得到LJ-2P核粒子。合成的LJ-2P NPs具有較高的單分散性，TEM測定其平均粒徑為≈25 nm, DLS測定其水動力直徑為≈44 nm(Figure.2C)。通過紫外-可見-紅外吸收光譜和NIR-II熒光發(fā)射光譜對LJ-2P和LJ-2P NPs的光物理性質進行了表征(Figure.2D)。LJ-2P和LJ-2P NPs在水中的zui大吸收波長分別為736 nm和773 nm。有趣的是，LJ-2P和LJ-2P NPs都表現(xiàn)出明顯的雙發(fā)射帶。LJ-2P和LJ-2P NPs在943 nm處表現(xiàn)出相似的窄發(fā)射帶，而寬發(fā)射帶分別在1059和1029 nm處。同時，我們測量了LJ-2P在FBS、H2O和THF中的QYs和LJ-2P NPs在H2O中的QYs(Figure.2E)。LJ-2P在THF中的QYs高達17.38%，表明了分子設計的*性。而隨著溶劑極性的增加，LJ-2P的QYs在H2O中急劇下降至0.14%。LJ-2P包封到LJ-2P NPs后，分子的亮度明顯恢復。與LJ-2P在水中相比，QYs增加了36.57倍，達到5.12%。此外，F(xiàn)BS中LJ-2P的QYs值為3.33%，增強了23倍，而在H2O中只有LJ-2P NPs的2/3。LJ-2P和LJ-2P NPs的光穩(wěn)定性是通過連續(xù)的激光照射（808 nm, 90 mWcm?2）60min來評估的。每10 min記錄熒光強度I/I0的變化(Figure.2F)。光穩(wěn)定性好，熒光強度無明顯下降。而ICG對照溶液的熒光強度在1 h內穩(wěn)定下降到接近0，表明ICG已經分解。

Figure 2

PEE機制：直觀地看，PEE可以限制沉淀染料的分子運動。在此，首先通過熒光強度測量來評估分子運動隨溫度升高的變化。當溫度從20℃升高到60℃時，LJ-2P的熒光強度被猝滅了67%，而在80℃時衰減達到91%。這表明LJ-2P在較高的溫度下存在劇烈的分子運動，并且光子衰變的大部分是通過非輻射途徑發(fā)生的。相比之下，LCP NPs的熒光強度在60℃和80℃時分別減弱了18%和33%，表明LJ-2P NPs內部的分子運動并不激烈。因此，我們認為納米顆粒內的沉淀劑嚴格約束了熒光團的運動。Figure.3AB分別為LJ-2P NPs和LJ-2P在780/740 nm激發(fā)下，功率強度為30μW的二維超快TA光譜。三種激發(fā)態(tài)動力學由LE（局部激發(fā)）和ICT（分子內電荷轉移）狀態(tài)之間的構象誘導電荷轉移速率（τ1），ICT狀態(tài)發(fā)射（τ2）和LE狀態(tài)發(fā)射（τ3）表征。然后我們提出了LJ-2P和LJ-2P NPs的電荷轉移反應路徑，如Figure.3C所示。與LJ-2P相比，LJ-2P的磷酸基與鈣離子的結合限制了分子的旋轉，導致LE和ICT態(tài)之間能量屏障更高。因此，LJ-2P NPs的LE狀態(tài)貢獻了更高比例的發(fā)射帶(Figure.2D)。實驗表明，納米粒子的形成進一步限制了水與熒光團的接觸，削弱了ESPT效應，從而引起了PEE現(xiàn)象(Figure.3E)。

Figure 3

體內血管和腫瘤成像：作者首先測試了LJ-2P NPs的腫瘤血管成像能力。用不同的LP過濾片測量活小鼠腫瘤血管的NIR-II熒光成像(Figure.4AC)。不同波長的空間分辨率由微血管的半zui大寬度(FWHM)來評價。同一位置的血管FWHM分別為352 (LP1000 nm)和314 (LP1150 nm)µm(Figure.4BD)。隨著濾光片波長的增加，出現(xiàn)了一個更尖銳的峰值(較低的FWHM)。此外，圖像的信噪比隨著LP濾光片波長的增加而增加。信噪比從LP1000 nm處的2.56增加到LP1150處的3.73。這些結果證實了LJ-2P NPs在腫瘤血管成像方面的卓yue性能。接下來，作者評估腫瘤部位隨時間變化的熒光強度。如Figure.4EF所示，腫瘤內熒光強度隨時間逐漸增加，在注射后約3 h達到峰值，腫瘤對正常組織的平均熒光強度zui高(T /NT = 4.84)。前3小時內的LJ-2P NPs在腫瘤的積累是由于增強的滲透性和保留 (EPR)效應。之后，腫瘤部位的熒光信號減弱，這是由于LJ-2P NPs的清除。最后時間點處死小鼠，切除主要臟器(心、肝、脾、肺、腎、腫瘤)進行HE染色。LJ-2P NPs無器官毒性。這些結果表明，LJ-2P NPs可作為NIR-II腫瘤診斷的熒光團。

Figure 4

體內代謝：最后，作者研究了LJ-2P NPs在體內的代謝。先前的研究表明，低pH可以溶解CaP核，導致NPs解離。X射線證明CaP的主要成分是羥基磷灰石，在酸性條件下表現(xiàn)出較高的溶解速率和較快的降解速率。在體外細胞水平也觀察到在低pH值下Ca2+的釋放。假設LJ-2P NPs在體內酸性環(huán)境下分解，釋放出水溶性的LJ-2P，促進進一步代謝（Figure.5A）。為了證明LJ-2P NPs對pH的敏感性，在pH 5.0、6.0和7.4緩沖液中進行體外釋放試驗(Figure.5B)。釋放時間為30 min時，LJ-2P NPs的Ca2+累積溶出度分別為8%、10%和80%，pH值分別為7.4、6.0和5.0。隨后，在pH值為7.4的緩沖液中，36 h內LJ-2P的NPs溶解率緩慢增加至14%，而在pH值為5.0時，LJ-2P的NPs溶解率達到89%。在pH6.0緩沖液中釋放是中等的，36 h釋放43%?；诹己玫捏w外實驗結果，進一步評估LJ-2P NPs在體內的肝保留情況。將LJ-2P NPs (2.5 mg kg -1)通過尾靜脈靜脈注入裸鼠(n = 6)，并于0.5 h、第1、2、4、6、8、11和14天進行全身NIR-II熒光成像，以監(jiān)測肝臟保留情況(Figure.5C)。熒光強度分析顯示，LJ-2P NPs在1天后代謝80%，第8天幾乎完quan代謝(Figure.5D)。為了進一步驗證LJ-2P NPs的熒光衰減可能是由于LJ-2P的代謝，而不是NPs的解體。我們將LJ-2P通過尾靜脈全身注射(2.5 mg kg?1)至裸小鼠(n = 6)，并在同一時間點進行全身NIR-II熒光成像(Figure.5E)。第4天80%的LJ-2P被代謝，14天內觀察到幾乎完quan分泌(Figure.5F)。

Figure 5

總結：綜上所述，作者通過引入兩個磷酸基合成了一種新型的水溶性NIR-II分子LJ-2P。提出了一種能顯著提高QYs的PEE策略，并詳細探討了PEE的具體機制，為今后提高QYs的工作提供了啟示。此外，LJ-2P NPs在肝臟中的保留時間較短。由于LJ-2P NPs具有優(yōu)異的光學性能和生物相容性，在血管和腫瘤成像中獲得了較高的腫瘤與正常組織的比例。PEE策略也可應用于其他NIR-II熒光團，以擴展生物應用。

參考文獻

DOI: 10.1002/smll.202204153

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