本文要點(diǎn)：目前，藥物性肝損傷（DILI）的診斷主要依靠排除法。此法耗時(shí)且不可靠，可能給后續(xù)治療帶來(lái)困難。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的方法來(lái)精確診斷DILI。一氧化氮（NO）被認(rèn)為是DILI早期統(tǒng)一、直接和重要的生物標(biāo)記物，目前，NO檢測(cè)的主要技術(shù)是化學(xué)發(fā)光成和di yi近紅外（NIR-I，650～900納米）窗口的熒光成像。然而，化學(xué)發(fā)光的半衰期太短，無(wú)法保證持續(xù)觀察。NIR-I熒光成像存在強(qiáng)光散射、組織吸收，限制了深層組織成像。關(guān)于分析物的定量檢測(cè)，比率熒光探針由于于其內(nèi)置的自校準(zhǔn)功能，允許更高的SBR和更準(zhǔn)確可靠的特定目標(biāo)檢測(cè)。目前用于NO活體成像的比率NIR-II熒光探針還尚未開(kāi)發(fā)。

作者合理設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了一種NO響應(yīng)性比率熒光納米探針DCNP@MPS@IR NO，該探針用于第二個(gè)近紅外（NIR-II）窗口熒光成像可以定量檢測(cè)NO和監(jiān)測(cè)DILI（圖1）。在NO存在的情況下，IR NO轉(zhuǎn)化為IR RA，DCNP@MPS@IR NO在808nm激發(fā)下（F1050Em，808Ex）在1050nm處呈現(xiàn)“開(kāi)啟"熒光信號(hào)，在980nm激發(fā)下（F1550Em，980Ex）在1550nm處呈現(xiàn)“始終開(kāi)啟"熒光信號(hào)，這導(dǎo)致了出現(xiàn)比率熒光信號(hào)F 1050Em，808Ex / F 1550Em，980Ex的“開(kāi)啟"。隨后作者將DCNP@MPS@IR NO應(yīng)用于肝損傷模型，體內(nèi)結(jié)果顯示DCNP@MPS@IR可用于量化撲熱息痛（APAP）誘導(dǎo)的肝損傷中的NO，監(jiān)測(cè)DILI，并通過(guò)NIR-II比率熒光成像篩選APAP的解毒劑。由此作者設(shè)想納米探針DCNP@MPS@IR NO在不久的將來(lái)可能成為一種非常有用的生物技術(shù)工具，用于藥物性肝損傷的可視化和早期診斷，并在臨床上揭示藥物肝毒性的機(jī)制。

首先基于分子內(nèi)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）依賴的熒光開(kāi)關(guān)機(jī)制，作者設(shè)計(jì)了一種小分子有機(jī)染料IR NO來(lái)響應(yīng)NO。如圖1a所示，作為電子受體的菁熒光團(tuán)與給電子的鄰苯二胺單元共軛以構(gòu)建IR NO。由于IR NO中的分子內(nèi)PET過(guò)程，菁熒光團(tuán)的熒光被猝滅。在NO存在下，IR NO的鄰苯二胺單元可轉(zhuǎn)化為弱給電子能力的苯并三唑，從而阻斷PET過(guò)程并恢復(fù)菁熒光團(tuán)的熒光。最后，獲得了發(fā)射波長(zhǎng)為1050nm（808nm激發(fā)）的NIR-II熒光IR-RA。然后，通過(guò)將NO敏感部分IR NO和內(nèi)標(biāo)物下轉(zhuǎn)換納米粒子（DCNP，在980nm激發(fā)時(shí)發(fā)射1550nm）整合到載體介孔SiO2（MPS）中，合理設(shè)計(jì)了NO響應(yīng)核～殼結(jié)構(gòu)NIR-II比率熒光納米探針DCNP@MPS@IR NO（圖1b）。DCNP作為核心首先被封裝到無(wú)定形二氧化硅中以形成核-殼結(jié)構(gòu)DCNP@SiO2.DCNP@Si2, 然后蝕刻和裝載IR NO以提供DCNP@MPS@IR NO。DCNP@MPS@IR NO體內(nèi)檢測(cè)NO使DILI可視化的機(jī)制如圖1c所示。過(guò)量的藥物攝入可導(dǎo)致肝組織損傷，加速L-精氨酸轉(zhuǎn)化為NO，并顯著增加肝細(xì)胞內(nèi)源性NO水平。在靜脈注射到患有DILI的小鼠體內(nèi)后，納米探針DCNP@MPS@IR NO由于肝臟的清除功能，將在肝臟中富集。在被內(nèi)化到肝細(xì)胞并被NO觸發(fā)時(shí)，DCNP@MPS@由于IR NO轉(zhuǎn)化為IR RA，IR NO在808 nm激發(fā)下（記錄為F 1050Em，808Ex）將在1050 nm處呈現(xiàn)“開(kāi)啟"NIR-II熒光。相反，DCNP@MPS@IR NO在980 nm激發(fā)下（記錄為F 1550Em，980Ex ）來(lái)自DCNP的1550 nm處的熒光信號(hào)的保持不變。因此，DCNP@MPS@IR-NO熒光強(qiáng)度比（ F 1050Em，808Ex / F 1550Em，980Ex）為NO響應(yīng)后升高。因此，使用該比率NIR-II熒光納米探針，可以在體內(nèi)精確定量和可視化NO濃度，從而進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)DILI的體內(nèi)比率熒光成像。

圖1：（a）示意圖顯示了基于分子內(nèi)PET依賴的“開(kāi)啟"熒光機(jī)制的IRNO對(duì)NO的響應(yīng)機(jī)制。（b） NO響應(yīng)納米探針DCNP@MPS@IR NO的制備步驟示意圖（c）NO響應(yīng)納米探針DCNP@MPS@IRNO用于體內(nèi)監(jiān)測(cè)藥物過(guò)量引起的肝損傷的圖示。過(guò)量的藥物（此處，對(duì)乙酰氨基酚（APAP）被用作模型藥物）會(huì)導(dǎo)致肝損傷，伴隨NO的過(guò)度表達(dá)。存在NO時(shí)，DCNP@MPS@IRNO中的IR NO將轉(zhuǎn)換為IRRA，并伴有“開(kāi)啟" F 1550Em，808Ex信號(hào)和“始終開(kāi)啟" F 1550Em，980Ex信號(hào)。利用F1050 Em、808 Ex和F1550 Em、980 Ex的比例，可以定量檢測(cè)小鼠DILI中的NO，從而在體內(nèi)監(jiān)測(cè)DILI。

NO響應(yīng)NIR-II比率熒光納米探針DCNP@MPS@IR NO的制備。通過(guò)使用親核取代反應(yīng)將菁染料IR 1061與DABT簡(jiǎn)單偶聯(lián)獲得IR NO（圖2a）. DABT、IR NO和IR 1061的紫外-可見(jiàn)-近紅外吸收光譜表明，DABT在400-1000 nm范圍內(nèi)沒(méi)有明顯的吸收峰，IR 1061在900 nm處有一個(gè)寬的吸收峰，在實(shí)驗(yàn)中無(wú)法觀察到IR NO的光譜， IR NO在812 nm處有一個(gè)微弱的近紅外吸收峰（圖2b）。當(dāng)在808nm激發(fā)時(shí)，IR NO和IR 1061在1050nm左右有一個(gè)熒光（FL）發(fā)射峰，而DABT發(fā)射一個(gè)可忽略的NIR-II熒光信號(hào)（圖2c）。特別是5μM IR-NO中的5μM IR 1061的熒光強(qiáng)度僅為84.9%，這是由于前者的細(xì)胞內(nèi)PET效應(yīng)。上述紫外-可見(jiàn)-NIR光譜和FL表征進(jìn)一步證實(shí)了具有猝滅熒光的IR NO的成功合成。

圖2：（a）IR NO的合成路線（b，c）紫外?可見(jiàn)?NIR吸收光譜（d?f） TEM圖像，DCNP（d）DCNP@SiO2（e） DCNP@MPS@IR NO（f）。（g） Zeta電位值DCNP@MPS和DCNP@MPS@IRNO  （h）紫外?可見(jiàn)?NIR吸收光譜5μM I R N O 在 DCM中，20ug/ml的DCNP@MPS和DCNP@MPS@IR NO在水中（i） 200μg/ml的DCNP, DCNP@MPS和DCNP@MPS@IR NO在水中的熒光光譜。

隨后，作者研究了IR-NO對(duì)NO的光學(xué)性質(zhì)。將PBS中的IR NO（10μM）與10μM NO在37°C下孵育15分鐘。然后，測(cè)定治療前后IR-NO的UV-可見(jiàn)光-近紅外吸收光譜和熒光光譜。如圖3a所示，在存在NO的情況下，457 nm處IR NO的zui da吸收峰分裂為428和511 nm處的兩個(gè)峰，同時(shí)在700 nm-1000納米范圍內(nèi)899納米處吸收增加。同時(shí)，IR-NO在1050nm處的熒光強(qiáng)度是未經(jīng)治療的9.2倍（圖3b）。這些結(jié)果表明，當(dāng)IR-NO的鄰苯二胺結(jié)構(gòu)與NO反應(yīng)形成一個(gè)供電子能力減弱的三唑環(huán)時(shí)，IR-NA中的PET效應(yīng)消失，NIR-II熒光信號(hào)立即恢復(fù)。同時(shí)，作者研究了DCNP@MPS@IRNO對(duì)NO的比率響應(yīng)。0.2毫克/毫升PBS中的DCNP@MPS@IR NO與不同濃度的NO孵育（0-100uM)在37°C下放置15分鐘，并在808/980 nm激光激發(fā)下記錄這些樣品的熒光光譜。觀察到，隨著NO濃度的增加，899 nm處的吸收逐漸增加（圖3c）。這歸因于納米探針中的IR NO在NO存在下轉(zhuǎn)化為IR RA，這與圖3a中的結(jié)果一致。正如預(yù)期的那樣，DCNP@MPS@IR NO的F1050 Em、808 EX信號(hào)隨著NO濃度的增加明顯增加（圖3d）。相比之下，F(xiàn)1550 Em、980 Ex信號(hào)在不同濃度的NO下顯示出較小的變化，這是由于該納米探針的DCNP具有ji hao的穩(wěn)定性（圖3e）。關(guān)聯(lián)DCNP@MPS@IRNO的FL強(qiáng)度比（F1050 Em，808 Ex/F1550 Em，980 Ex）隨著NO濃度的增加，我們發(fā)現(xiàn)F1050 Em，808 Ex/F1550 Em，980 Ex強(qiáng)度與NO濃度（0-100μM）具有線性關(guān)系（Y=0.006220X +0.2044，R2=0.9933）（圖3f）。DCNP@MPS@IR NO對(duì)NO計(jì)算的檢測(cè)限（LOD）為0.61μM。上述結(jié)果充分驗(yàn)證了應(yīng)用熒光比率納米探針DCNP@MPS@IRNO定量檢測(cè)NO的可行性。

圖3：（a，b）紫外線-可見(jiàn)光-近紅外吸收光譜（a）和熒光光譜（b）10μM IR NO在PBS中用10μM N O 在 37°C處理15 min前后。（c～e）紫外線-可見(jiàn)-近紅外吸收光譜（c）和熒光光譜（d，e）0.2mg/ml PBS中DCNP@MPS@IR NO用不同濃度NO處理的（0～100uM），37℃下15分鐘。（f）DCNP@MPS@IR-NO的 FL信號(hào)比（F1050 Em，808 Ex/F1550 Em，980 Ex）隨NO濃度的增加而增加的線性關(guān)系。（g，h）F1050 Em，808 Ex信號(hào)強(qiáng)度（g）F1550 Em，980 Ex信號(hào)強(qiáng)度（h）0.2毫克/毫升PBS中的DCNP@MPS@IR NO在37°C下，不使用任何物質(zhì)（空白）或各種分析物（100μM）處理15分鐘（i）從面板（g，h）中獲取NIR-II比率熒光強(qiáng)度。

APAP是一種比較常見(jiàn)的解熱鎮(zhèn)痛藥。最近的一項(xiàng)研究表明，過(guò)量服用APAP可導(dǎo)致以肝小葉的中間纖維化為特征的肝損傷。作者選擇APAP誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型來(lái)研究DCNP@MPS@IR NO用于檢測(cè)體內(nèi)NO和監(jiān)測(cè)DILI的能力。小鼠首先腹腔注射過(guò)量的APAP（300 mg/ml）建立肝損傷模型。六小時(shí)后，DCNP@MPS@IR NO（2mg/ml, 尾靜脈注射200μL（記錄為APAP組）。在808/980nm激光激發(fā)下，在1050/1550nm處記錄每只小鼠的NIR-II熒光時(shí)間過(guò)程圖像。如圖4a所示，小鼠的肝臟區(qū)域可以在1050和1550 nm處清晰地映射NIR-II FL信號(hào)。值得注意的是，DCNP@MPS@IR-NO中屬于IR NO的1050 nm的FL信號(hào)在注射后90min內(nèi)顯示出隨時(shí)間變化的增加模式，在90分鐘時(shí)達(dá)到ding feng，與5分鐘時(shí)相比，信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)了2.5倍（圖4a，b）。這些結(jié)果表明DCNP@MPS@IR-NO對(duì)APAP誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝臟中的NO有有效的反應(yīng)，在90min內(nèi)納米探針在肝臟中的轉(zhuǎn)化率高于其清除率，隨后，兩個(gè)進(jìn)程保持平衡。相比之下，在1550 nm處，來(lái)源于NO-不敏感DCNP的肝臟區(qū)域的熒光信號(hào)在5分鐘內(nèi)迅速達(dá)到zui da值，并且在整個(gè)150分鐘的監(jiān)測(cè)期間表現(xiàn)出可忽略的變化，這表明納米探針在5分鐘內(nèi)在肝臟中迅速積累，在其富集率和消除率之間保持平衡，并在隨后的觀察期內(nèi)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性（圖4a，c）?；?050nm和1150nm處的熒光信號(hào)，獲得了f1050em、808ex/f1550em和980ex的時(shí)程近紅外-Ⅱ比值信號(hào)。正如預(yù)期的那樣，這一比率在前90分鐘內(nèi)顯示出上升趨勢(shì)，在隨后的60分鐘內(nèi)幾乎沒(méi)有波動(dòng)，這與F1050Em，808 Ex信號(hào)的趨勢(shì)*一致（圖4a，d）。特別是，90分鐘（0.5±0.02）的比值為5分鐘（0.21±0.001）時(shí)的2.4倍，清楚地指示“開(kāi)啟"F1050Em、808 Ex/F1550 Em、980 Ex信號(hào)。實(shí)際上，使用90分鐘時(shí)的比率信號(hào)值和圖3f中的線性關(guān)系，計(jì)算出肝臟中的NO濃度為47.5± 3.8uM, 總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果很好地證明DCNP@MPS@IR NO基于NO的F1050 Em、808 Ex/F1550Em、980 Ex信號(hào)的觸發(fā)“開(kāi)啟"，有可能用于定量檢測(cè)NO和可視化DILI。

圖4：（a） APAP組小鼠的時(shí)間歷程N(yùn)IR-II FL圖像和相應(yīng)的比率圖像。（b，c）1050nm處相應(yīng)的量化平均熒光強(qiáng)度（b）1550nm（c）記錄時(shí)間點(diǎn)的肝臟區(qū)域。（d）記錄時(shí)間點(diǎn)肝臟區(qū)域的相應(yīng)量化平均比率信號(hào)；1050和1550 nm分別代表F1050 Em、808 Ex和F1550 Em、980 Ex。比率代表F1050 Em、808 Ex/F1550 Em、980 Ex。

為了進(jìn)一步確認(rèn)1050nm處的“開(kāi)啟"NIR-II熒光信號(hào)和“開(kāi)啟"比率信號(hào)確實(shí)是由APAP誘導(dǎo)的肝損傷期間產(chǎn)生的NO引起的，作者隨后在沒(méi)有DILI的小鼠上進(jìn)行NIR-II熒光成像。給小鼠注射藥物DCNP@MPS@IR NO（2毫克/毫升-尾靜脈注射PBS（300μL）（記錄為PBS組）6小時(shí)后，通過(guò)尾靜脈注射200μL）。然后在808/980 nm激光激發(fā)下，在1050/1550 nm處收集每只小鼠的時(shí)間歷程N(yùn)IR-II熒光圖像。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)150分鐘的觀察期內(nèi)，距離肝臟區(qū)域1050 nm處的FL信號(hào)沒(méi)有顯示任何增加，并且遠(yuǎn)弱于APAP組（圖4a、b和5a、b）。特別是，90分鐘時(shí)的FL強(qiáng)度為在同一時(shí)間點(diǎn)APAP組的1/2.8。這些結(jié)果表明，DCNP@MPS@IR-NO由于肝臟中的低NO濃度，IR NO沒(méi)有轉(zhuǎn)化為IR RA。同時(shí)，1550 nm處的熒光在監(jiān)測(cè)期間保持明亮，沒(méi)有明顯變化，這與APAP組一致（圖5c）。此外，F(xiàn)1050 Em、808 Ex/F1550 Em、980 Ex的比率信號(hào)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)保持在約0.2的低值（圖5d）。值得注意的是，使用90分鐘時(shí)的比值（0.21±0.0004）和圖3f中的線性關(guān)系，PBS組肝臟的NO濃度計(jì)算為0.96 ± 0. 06μM，顯著低于APAP組（47.5±3.8μM）（P<0.01）。這一結(jié)果進(jìn)一步表明APAP組肝臟NO水平異常。上述結(jié)果表明，納米探針的F1050 Em、808 Ex信號(hào)和F1050 Em、808 Ex/F1550 Em、980 Ex比例信號(hào)在體內(nèi)的“開(kāi)啟"主要?dú)w因于肝臟中NO的過(guò)度表達(dá)。

圖5。（a） PBS組小鼠的時(shí)間歷程N(yùn)IR-II FL圖像和相應(yīng)的比率圖像。（b，c）1050nm處相應(yīng)的量化平均熒光強(qiáng)度（b）1550nm（c）記錄時(shí)間點(diǎn)的肝臟區(qū)域。（d）記錄時(shí)間點(diǎn)肝臟區(qū)域的相應(yīng)量化平均比率信號(hào)；1050和1550 nm分別代表F1050 Em、808 Ex和F1550 Em、980 Ex。比率代表F1050 Em、808 Ex/F1550 Em、980 Ex。

在臨床上，NAC是APAP中毒的常用解毒劑，可用于減輕APAP引起的肝損傷，副作用小。作者研究了納米探針DCNP@MPS@IR-NO是否可用于評(píng)價(jià)NAC對(duì)APAP所致肝損傷的修復(fù)作用。按照APAP組的方法建立APAP誘導(dǎo)的肝損傷模型。然后注射APAP5小時(shí)后將小鼠腹腔注射NAC（300 mg /ml）以減輕肝損傷，1小時(shí)后，DCNP@MPS@IR NO（2mg/ml, 尾靜脈注射200μL（記錄為APAP-NAC組）。然后在808/980 nm激光激發(fā)下，在1050/1550 nm處獲得每只小鼠的時(shí)間歷程N(yùn)IR-II熒光圖像。如圖6a，b所示，肝臟區(qū)域1050 nm處的FL信號(hào)在90分鐘時(shí)緩慢增加至ding feng，信號(hào)強(qiáng)度僅為5分鐘時(shí)的1.04倍。F1050-Em，808-Ex信號(hào)的“開(kāi)啟"程度遠(yuǎn)低于APAP組，這是由于NAC治療后NO含量減少所致。與APAP組和PBS組一樣，APAP-NAC組小鼠的肝臟區(qū)域在整個(gè)觀察期間在1550 nm處發(fā)出明亮穩(wěn)定的熒光（圖6a，c）。因此，APAP NAC組的比率FL信號(hào)的“開(kāi)啟"程度遠(yuǎn)低于APAP組，90分鐘時(shí)F1050 Em、808 Ex/F1550 Em、980 Ex的zui da信號(hào)強(qiáng)度僅為APAP組中在同一時(shí)間點(diǎn)的1/2.4。上述結(jié)果充分證明NAC能有效減輕APAP誘導(dǎo)的肝損傷，DCNP@MPS@IR NO在篩選DILI解毒劑方面大有可為。

圖6：（a） APAP-NAC組小鼠的時(shí)間歷程N(yùn)IR-II FL圖像和相應(yīng)的比率圖像。（b，c）相應(yīng)的量化平均熒光強(qiáng)度1050nm（b）和1550nm（c）記錄時(shí)間點(diǎn)的肝臟區(qū)域。（d）記錄時(shí)間點(diǎn)肝臟區(qū)域的相應(yīng)量化平均比率信號(hào)；1050和1550 nm分別代表F1050 Em、808 Ex和F1550 Em、980 Ex。比率代表F1050 Em、808 Ex/F1550 Em、980 Ex 。

參考文獻(xiàn)

Bai Feicheng,et al."A NO-Responsive Ratiometric Fluorescent Nanoprobe for MonitoringDrug-Induced Liver Injury in the Second Near-InfraredWindow.." Analytical chemistry .(2021):doi:10.1021/ACS.ANALCHEM.1C02238.

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