本文要點(diǎn)：原發(fā)性肝腫瘤的準(zhǔn)確診斷和有效治療具有重要意義，光學(xué)成像已廣泛應(yīng)用于臨床影像引導(dǎo)下的肝腫瘤手術(shù)。第二近紅外窗口(NIR-II)發(fā)射的AIEgen光敏劑以其更高分辨率的生物成像和更深的穿透性而備受關(guān)注。NIR-II聚集誘導(dǎo)發(fā)光物質(zhì)(AIEgen)光敏劑在影像引導(dǎo)手術(shù)/光療中具有更好的光療效果和準(zhǔn)確性。在此，本文提出了一種NIR-II AIEgen光熱消融點(diǎn)，用于NIR-II影像引導(dǎo)下的原位肝腫瘤切除手術(shù)和光療。與吲哚青綠(ICG)相比，AIEgen斑點(diǎn)在1250 nm處表現(xiàn)出明亮而銳利的近紅外(NIR-II)發(fā)射，并延伸到1600 nm處，具有很高的光穩(wěn)定性。此外，AIEgen DOTS有效地產(chǎn)生了用于光動(dòng)力治療的活性氧(ROS)。對(duì)體內(nèi)和體外原位肝腫瘤的研究表明，AIEgen DOTS既可以用于早期腫瘤的影像引導(dǎo)腫瘤手術(shù)，也可以用于“降級(jí)"縮小腫瘤大小的意圖。此外，該治療策略*抑制了原位腫瘤，無(wú)復(fù)發(fā)，副作用少。

方案1 NIR-II發(fā)射型AIEgen光敏劑PTZ-TQ的示意圖，該光敏劑能夠?qū)崿F(xiàn)超靈敏的成像引導(dǎo)手術(shù)和光療以*抑制原位肝腫瘤

圖1 a)PTZ-TQ分子的合成路線b)PTZ-TQ在四氫呋喃(THF)和水體積分?jǐn)?shù)(FW)為95%的THF/H2O中的b)吸收光譜c)PTZ-TQ在THF/H2O(FW，0%~95%)中的發(fā)射d)發(fā)射強(qiáng)度比(I/I0),根據(jù)PTZ-TQ在不同F(xiàn)W下的(c)計(jì)算e)PTZ-TQ在四氫呋喃/水(FW，95%)和純四氫呋喃中的近紅外-II熒光圖像f)經(jīng)1%脂質(zhì)體溶液檢測(cè)PTZ-TQ和ICG的信號(hào)強(qiáng)度g)計(jì)算了PTZ-TQ的HOMO和LOMO

圖2 a) PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的TEM圖像b)水中PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的尺寸分布c)PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在水溶液中的UV-Vis-NIR吸收光譜和NIR-II熒光發(fā)射光譜d)PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在間歇808 nm激光(0.25W/cm2)照射60min下在PBS、FBS和DMEM中的光穩(wěn)定性.e)吸光度和f)在808 nm激光(0.25W/cm2)連續(xù)照射30min下的NIR-II熒光發(fā)射g)PTZ-TQ-AIE在水中的 NIR-II熒光圖像h)PTZ-TQ-AIE和ICG通過(guò)不同濃度的1%磷脂溶液的信號(hào)強(qiáng)度

首先，采用納米沉淀法制備了PTZ-TQ-AIE點(diǎn)。透射電子顯微鏡(TEM)測(cè)得PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的尺寸約為80 nm，動(dòng)態(tài)光散射(DLS)分析測(cè)得其尺寸約為255 nm(圖2A，b)，水溶液中PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的UV-VIS-NIR吸收光譜和NIR-II熒光發(fā)射光譜表明，675 nm處的吸收峰擴(kuò)展到900 nm，1150 nm處的熒光發(fā)射峰和發(fā)射尾部的熒光發(fā)射峰擴(kuò)展到接近1600 nm(圖2C)。在808 nm激光激發(fā)下，水溶液中PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的量子產(chǎn)額(QY)為0.3%。PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在PBS、FBS和DMEM介質(zhì)中表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性。當(dāng)用功率密度為0.25W/cm~2的808 nm激光連續(xù)照射PTZ-TQ-AIE點(diǎn)30min時(shí)，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的吸收和發(fā)射光譜沒(méi)有明顯變化(圖2D，e)。此外，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在磷酸鹽緩沖液(PBS)、培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清(FBS)中的發(fā)光強(qiáng)度在相同密度下連續(xù)照射60min后沒(méi)有變化(圖2F)。PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的光穩(wěn)定性遠(yuǎn)好于商品化的ICG染料，表明PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)具有良好的體內(nèi)長(zhǎng)期熒光成像潛力。

接著，用不同的濾光片測(cè)量了NIR-IIb的熒光強(qiáng)度。PTZ-TQ-AIE點(diǎn)顯示出比PTZ-TQ(FW=95%)(圖2G)更好的NIR-IIa(1000-1300nm)和NIRIIb(1400-1700 nm)熒光信號(hào)。此外，在1050 nm的熒光穿透深度表明，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在8毫米的深度可以分辨出更銳利的毛細(xì)管邊緣；在相同的條件下，ICG只在4毫米的深度顯示出類(lèi)似的分辨率(圖2H)。

圖3 電子順磁共振(EPR)譜檢測(cè)1O2的產(chǎn)生a)記錄不同濃度(0~30μg/mL)的Ptz-TQ-AIE點(diǎn)的1O2探針的b)熒光光譜(實(shí)線：激光照射，虛線：不照射),不同時(shí)間照射下，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)氧探針的c)熒光強(qiáng)度d)DCFH-DA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生e)鈣黃綠素-AM(活細(xì)胞的綠色熒光)和PI(死亡細(xì)胞的紅色熒光)共染色的HepG2細(xì)胞的E熒光圖像f)PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)與808 nm近紅外激光(0.25W/cm2)孵育24小時(shí)后對(duì)LO2細(xì)胞、HepG2細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用

接下來(lái)，用二氯二氫化熒光素二乙酸酯評(píng)價(jià)了PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的活性氧生成能力以DCFH-DA)作為指標(biāo)。在PTZ-TQ-AIE點(diǎn)(808 nm，0.25W/cm2)存在下，DCFH-DA的熒光隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)而急劇增加。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，電子順磁共振(EPR)被用來(lái)驗(yàn)證ROS的產(chǎn)生。在5 mm的活性氧指示劑TEMPONE與PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在溶液中孵育后，然后照射5分鐘進(jìn)行EPR測(cè)量，當(dāng)添加β-胡蘿卜素時(shí)EPR信號(hào)減少(圖3A)，證明了1O2的有效產(chǎn)生。為了了解生成的物種，shou ci 使用單線態(tài)氧傳感器綠(SOSG)來(lái)評(píng)估1O2的生成。在PTZ-TQ-AIE點(diǎn)(808 nm，0.25W/cm2)照射下，SOSG的熒光隨照射時(shí)間的增加而急劇增加，證實(shí)1O2是主要的活性氧(圖3B，c)。由于PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)具有優(yōu)良的近紅外發(fā)射和活性氧產(chǎn)生能力，因此研究了該斑點(diǎn)在癌癥診斷和治療中的應(yīng)用潛力。如圖3D所示，在輻射下，PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)加激光組顯示DCFH-DA的亮綠色熒光，表明ROS的產(chǎn)生被有效地誘導(dǎo)，并通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生進(jìn)行了定量。ROS的有效產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞死亡(圖3e)。然而，只有輻照或PTZ-TQ-AIE點(diǎn)顯示出可以忽略的紅色熒光，這表明PTZ-TQ-AIE點(diǎn)具有良好的生物相容性，單獨(dú)激光照射的危害有限(圖3e)。以正常肝細(xì)胞為對(duì)照，體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，在100μg/mL濃度下，PTZTQ-AIE dots對(duì)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞幾乎沒(méi)有明顯的毒性作用。3F)。此外，PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)和輻射導(dǎo)致細(xì)胞存活率顯著降低，證明了體外光動(dòng)力療法(PDT)療效，且PTZ-TQAIE點(diǎn)劑本身副作用較小。

圖4 a)在尾靜脈注射PTZ-TQ-AIE點(diǎn)后120s、300s和15min的活體長(zhǎng)期后肢血管NIR-II成像b)根據(jù)(a)(120秒)中沿黃線測(cè)量的橫截面強(qiáng)度剖面測(cè)量的血管半高寬寬度，峰值擬合為高斯函數(shù)c)尾靜脈注射PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)后不同時(shí)間點(diǎn)，取原位肝癌大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的活體長(zhǎng)期近紅外熒光圖像，白色圓圈表示腫瘤。d）肝臟和腫瘤的圖像e)NIR-II光學(xué)成像引導(dǎo)腫瘤切除圖示f)NIR-II和生物發(fā)光成像在手術(shù)中的應(yīng)用g)荷瘤小鼠的相對(duì)腫瘤生長(zhǎng)曲線及相應(yīng)的熒光強(qiáng)度h)肝解剖治療后的照片

然后，為了進(jìn)一步研究PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的近紅外成像和光動(dòng)力學(xué)治療能力，shou ci 對(duì)PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的體內(nèi)生物相容性和生物分布進(jìn)行了評(píng)價(jià)。給健康BALB/c小鼠靜脈注射PTZ-TQ-AIE點(diǎn)(2 00μL，5 0 0μg/mL)后，采集血樣，進(jìn)行分析，主要血細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)明顯變化，提示PTZ-TQ-AIE點(diǎn)具有良好的生物相容性。PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)在肝臟和脾臟中有較高的蓄積，表明PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的清除途徑是通過(guò)肝膽系統(tǒng)。與ICG相比，PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的血液循環(huán)半衰期相對(duì)較長(zhǎng)，為61±21分鐘，然后對(duì)PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的血管成像性能進(jìn)行了研究。注射后2分鐘、5分鐘和15分鐘通過(guò)NIR-II成像可以清楚地顯示血管系統(tǒng)(圖4A)。此外，后肢血管的分辨率(711.8μm)是通過(guò)測(cè)量高斯擬合的半高寬(FWHM)(圖4B)達(dá)到的，這將足以用于外科手術(shù)。

為了評(píng)價(jià)深部組織的成像和治療，建立了裸鼠原位肝腫瘤模型。將螢火蟲(chóng)熒光素酶基因轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞，經(jīng)剖腹接種于肝右葉。在確認(rèn)成功建立原位肝腫瘤后，將PTZTQ-AIE斑點(diǎn)(200μL，500μg/mL)靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)。在808 nm激光的激發(fā)下，正常肝臟和腫瘤部位的NIR-II熒光被連續(xù)記錄。在注射后2h，離體結(jié)果顯示腫瘤部位的NIR-II熒光信號(hào)低于正常肝組織；腫瘤中較低的NIR-II信號(hào)清楚地識(shí)別了腫瘤與正常肝器官之間的邊界，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在注射后48小時(shí)達(dá)到 zui da (圖4C，注射后48h，腫瘤區(qū)域可見(jiàn)明亮銳利的NIR-II信號(hào)。NIR-II熒光成像的信噪比(SNR)隨時(shí)間逐漸增加，48h達(dá)到 zui da 值。為了進(jìn)一步確定腫瘤的位置，在注射后96h拍攝了整個(gè)肝組織（圖4D)；定位與在活體NIR-II圖像上觀察到的位置一致(圖4C中的圓圈)。這些結(jié)果表明，在注射后2h通過(guò)負(fù)強(qiáng)化或在注射后48h通過(guò)正強(qiáng)化可以清楚地識(shí)別腫瘤與正常肝器官之間的邊界。因此，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在注射后2h和48h均可用于影像引導(dǎo)手術(shù)，可根據(jù)腫瘤大小提供個(gè)性化的治療選擇。

鑒于PTZ-TQ-AIE點(diǎn)是較強(qiáng)的活性氧發(fā)生器，研究了PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在光動(dòng)力治療中應(yīng)用的可行性，以縮小腫瘤的體積，以便進(jìn)一步手術(shù)切除，防止腫瘤的復(fù)發(fā)。因此，采用了不同的治療方法：對(duì)于較大的腫瘤，*行PDT治療以縮小腫瘤體積，然后進(jìn)行手術(shù)以 zui da 限度地減少治療過(guò)程中對(duì)肝臟的損傷(稱(chēng)為PDT+手術(shù))；對(duì)于較小的腫瘤，*行手術(shù)，然后對(duì)殘留的腫瘤進(jìn)行PDT治療(稱(chēng)為手術(shù)+PDT)。治療過(guò)程由BLI監(jiān)測(cè)，用總BLI強(qiáng)度和相對(duì)腫瘤生長(zhǎng)來(lái)總結(jié)不同治療方法下的腫瘤生長(zhǎng)情況。如圖4G所示，對(duì)照組(PBS、PBS+激光和PTZ-TQ-AIE點(diǎn))的BLI信號(hào)迅速增加，表明腫瘤生長(zhǎng)速度較快。單一的治療過(guò)程(PDT或手術(shù))導(dǎo)致BLI信號(hào)顯著降低，證明了單一影像引導(dǎo)手術(shù)或PDT在腫瘤治療中的有效性。然而，兩個(gè)單一治療過(guò)程中的腫瘤隨著時(shí)間的推移而復(fù)發(fā)(圖4G中的綠色和粉紅色曲線)。早期治療取得了與單一治療過(guò)程相似的療效，但在觀察期內(nèi)無(wú)腫瘤復(fù)發(fā)(圖4G中紫色和深藍(lán)色曲線)。

最后模擬了一個(gè)不適合手術(shù)的大型肝癌模型(圖4G中的紫色曲線)。在臨床環(huán)境中，“降級(jí)"意圖包括預(yù)處理以減小活躍腫瘤的大小或數(shù)量。首先使用PDT來(lái)減小尺寸，PDT治療后，BLI信號(hào)在治療后第7天急劇下降，然后進(jìn)行手術(shù)以實(shí)現(xiàn)幾乎*的腫瘤抑制(圖中紫色曲線。4G)。體內(nèi)肝臟的磁共振成像(MRI)和體外照片證實(shí)，多種治療組幾乎沒(méi)有腫瘤結(jié)節(jié)(圖4h）。

參考文獻(xiàn)

JiaR, Xu H, Wang C, Su L, Jing J, Xu S, Zhou Y, Sun W, Song J, Chen X, Chen H.NIR-II emissive AIEgen photosensitizers enable ultrasensitive imaging-guidedsurgery and phototherapy to fully inhibit orthotopic hepatic tumors. JNanobiotechnology.

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