本文要點：第二近紅外窗口(NIR-II)熒光成像技術以其高靈敏度、高分辨率、可深入組織等特點，在體內(nèi)的各種應用中成為一項新興技術。本文報道了一種以[1，2，5]噻二唑[3，4f]苯并三唑(TBZ)取代BBTD作為電子受體的NIR-II熒光分子的合理設計和合成。由于TBZ核的電子缺陷比BBTD弱，新制備的NIR-II分子基納米粒子在水中具有更高的質量消光系數(shù)和量子產(chǎn)率。NIR-II BTB納米顆?？梢赃M行視頻率熒光成像，用于小鼠耳朵、后肢和大腦的血管成像。此外，它在NIR-I區(qū)的巨大吸收率也促進了使用光聲顯微鏡(PAM)和層析成像(PAT)的生物成像。在與Arg-Gly-Asp(RGD)肽表面偶聯(lián)后，功能化的納米顆粒確保了通過二維和三維圖像方式對整合素過表達的腫瘤進行靶向檢測。因此，對有機熒光團工程受體的研究提供了一種很有前途的分子設計策略，可以為多種生物醫(yī)學成像應用提供新的NIR-II熒光。

光聲成像(PAI)可以提供精確描述人體大小的三維圖像。NIR-II區(qū)域具有衰減的光散射和背景自發(fā)熒光，NIR-II成像在顯示深部解剖特征方面顯示出巨大的潛力，具有高靈敏度和清晰度，提供了傳統(tǒng)熒光成像技術不能很容易揭示的生物體內(nèi)的關鍵信息。NIR-II FLI和NIR-I PAI相結合的雙模式成像，發(fā)揮了各自的優(yōu)勢，彌補了各自的固有缺陷，提高了成像的準確性，在有效的腫瘤診斷中具有廣闊的應用前景。為了獲得NIR-II發(fā)射，一種強缺電子單元，苯并雙噻二唑(BBTD)，已被廣泛用作受體(圖1a)。由于分子內(nèi)電荷轉移(ICT)效應的存在，這些熒光團通常在水相中存在低的量子產(chǎn)率(QYS)。發(fā)展了許多策略來增強QYS，包括染料與蛋白質疏水結構域的雜交，在分子結構中引入屏蔽單元等。大多數(shù)報道的D-A-D結構的NIR-II熒光團的QYS仍然相對較低，因為它們固有的ICT效應。因此，探索新的受體單元對于為實際應用提供更多可供選擇的NIR-II有機分子設計策略具有重要意義。

方案1 ：BBT的合成路線

考慮到電荷轉移能力的強度可以通過改變受主單元來調節(jié)，用相對較弱的受主取代BBTD是一種很有前途的抑制ICT效應的方法，可以用增強的NIR-II熒光基團的QY來抑制ICT效應。本文以噻二唑苯并三唑為受體，通過對受體單元的合理設計，合成了一種新型D-A-D結構的近紅外熒光載體，苯并三唑(BTB)，并將其制備成納米粒子(BTB NPs)，用于雙近紅外光聲/近紅外II熒光成像。還利用RGD共軛的BTB納米粒子實現(xiàn)了靶向腫瘤成像。該研究為設計和合成用于高級生物醫(yī)學研究的新型NIR-II熒光載體打開了一扇新的大門。

圖2：(A)BTB NP示意圖(B)使用DLS測量水中BTB NPs的大小(C)BTB NPs的TEM圖像(D)BTB納米粒子(黑色)和BBT納米粒子(紅色)在水中的歸一化UV-VIS-NIR和PL光譜(E)積分熒光強度曲線圖(F)BTB在甲苯中、BTB納米粒子在水中和BBT在甲苯中的量子產(chǎn)率(G)BTB NPs在水中的PA光譜(62.5µg mL-1)，與純水形成對比(H)在730 nm激發(fā)時，PA信號強度隨BTB納米粒子濃度的變化(I)在730 nm激發(fā)下，雞胸組織中不同深度的BTB納米粒子(62.5µgmL-1)的PA信號

通過改進的納米沉淀法(圖2a)制備了可水分散的納米粒子。先考察了BTB和BBT在甲苯中的吸收光譜和發(fā)射光譜，以及它們在水中的吸收和發(fā)射光譜，考察了受體單元對分子光學性質的影響。首先這兩個分子的吸收光譜都顯示出兩個吸收帶：di yi 個吸收帶在30 0~5 0 0 nm范圍內(nèi)可歸屬于共軛骨架的π-π*和n-π*躍遷，第二個吸收帶在5 0 0~1 1 0 0 nm范圍內(nèi)，這表明這兩個分子在極性較弱的溶劑中表現(xiàn)出比在極性溶劑中更強的熒光。此外，與它們的甲苯溶液相比，這兩種納米粒子在水中的吸收光譜都發(fā)生了展寬和紅移，這歸因于納米粒子形成時的緊密分子堆積行為。其次，與BBT納米粒子相比，BTB納米粒子在730 nm處有藍移的吸收峰，但在水中的 zui da 吸收處的消光系數(shù)約為2.4倍(BTB納米粒子在730 nm處的消光系數(shù)為19.6L g-1 cm-1，而BBT納米粒子在808 nm處的消光系數(shù)為8.2L g-1 cm-1)。第三，BTB納米粒子有很強的發(fā)射，峰值位于898nm，尾部密集延伸到1400 nm，而BBT納米粒子的發(fā)射光譜在相同條件下仍然無法檢測到(圖2d)。將BTB納米粒子封裝成納米粒子后，QY降至0.48%(圖2e-2f)，而BBT納米粒子由于熒光很弱，無法計算其量子效率。與BBT相比，BTB及其NPs的QY更高，這可以歸因于以TBZ為接受者的ICT效應的降低?；谝陨嫌^察結果表明，BTB納米粒子適合于生物醫(yī)學成像，TBZ部分是構建明亮的NIR-II熒光載體的一種有前途的候選材料。

圖3：(A)小鼠尾靜脈注射BTB NPs的示意圖(b-d)靜脈注射100g的BTB NPs后，小鼠后肢血管(B)、耳血管(C)和腦血管(D)的代表性近紅外-II熒光圖像(E)皮下注射BTB NPs用于淋巴成像的示意圖(F)注射BTB NPs的小鼠淋巴管和淋巴結的代表性NIR-II熒光圖像(G)經(jīng)尾靜脈注射BTB NPs的小鼠耳血管(H)和腦血管(I)的PAM成像中，沿紅線的橫截面熒光強度剖面(和高斯擬合)，以綠色圈出

為了評估BTB納米粒子在動物循環(huán)系統(tǒng)成像中的潛力，我們分別使用定制的動物熒光成像系統(tǒng)和PAM，通過NIR-II熒光和NIR-I PA技術在小鼠身上進行了血管成像。對靜脈注射BTB NPs(1000LP)的C57BL/6J小鼠進行了耳部、后肢和腦內(nèi)血管網(wǎng)的實時視頻速率NIR-II熒光成像。注射NP后10min(50?g/只)，在功率密度為100mW cm-2的785 nm激發(fā)下，可清晰顯示后肢、耳和腦的血管構筑(圖3a-d)。結果表明，后肢血管、耳血管和腦血管的熒光譜半高寬分別為76.0、71.6和110.3?m，具有較高的靈敏度和良好的空間分辨率。此外，經(jīng)小鼠側腹皮下注射BTBNPs時，注射部位附近的淋巴結被點亮，顯示淋巴管的分辨率高，半高寬為454.0?m(圖3e-g)。然后，使用PAM進一步展示了BTB納米顆粒在體內(nèi)血管成像中提供的良好的空間和時間分辨率。將裸鼠麻醉后置于成像階段，然后對耳部和腦部的血管進行成像。靜脈給藥時，在730 nm脈沖激光激發(fā)下，血管被點亮并清晰地觀察到(圖3h-i)。在PAM下測得耳血管的半高寬為223.0?m，優(yōu)于文獻中在PAT下獲得的分辨率。16在去除頭皮的腦血管成像中，橫竇和上矢狀竇都能清楚地顯示出來(圖3I)。此外，大腦下靜脈也發(fā)出PA信號。

圖4：(A)在808 nm半導體激光器(140 mW cm-2)激發(fā)下，在143B荷瘤小鼠中使用BTB NPs超過72小時的代表性NIR-II FLI；(濾光片：1000 nm長通。箭頭表示皮下腫瘤(每組4例)比例尺：5 mm(B)基于BTB NPs的143B腫瘤顯像的T/NT比值超過72h(C)注射BTB(左，Video S1)或BTB-RGD NPs(右，Video S2)48h后，小鼠143B腫瘤光聲圖像(激發(fā)波長為730 nm)的三維體積再現(xiàn),比例尺=2 mm

為了提高成像探針在腫瘤部位的聚集，實現(xiàn)體內(nèi)準確診斷，將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)肽作為靶向配體修飾到BTB-NP表面，制備BTB-RGD納米粒。首先研究了共聚焦圖像，以證實BTB-RGD納米顆粒對腫瘤細胞的靶向能力。與40μg mL-1的BTBRGD納米顆粒單獨孵育后，癌細胞的熒光信號明顯高于無功能的BTB納米顆粒對照組。相比之下，正常3T3細胞與BTB-RGD納米顆粒孵育后的熒光強度與BTB-RGD納米顆粒孵育后的熒光強度無明顯差異。這些結果表明，RGD功能化納米探針的靶向性可以促進αvβ3整合素高表達的腫瘤細胞對RGD48、49特異性結合的腫瘤細胞的細胞內(nèi)化。在裸鼠皮下接種143B骨肉瘤細胞和PC3前列腺癌細胞后，檢測了腫瘤的靶向性，結果表明，RGD功能化納米探針的靶向性可以促進RGD48、49整合素高表達的腫瘤細胞對RGD48、49的靶向性。每種腫瘤分別用兩組荷瘤小鼠證實BTB-RGD納米粒(每組4只)的靶向性。如圖4a-b所示，荷瘤小鼠在注射BTB-RGD NP后48h，腫瘤部位的NIR-II熒光信號逐漸增強，并達到zuida值。然而，注射BTB NPs的小鼠腫瘤部位的信號在試驗期內(nèi)只顯示出有限的增強。此外，注射BTB-RGD納米粒的小鼠腫瘤部位的熒光強度在各時間點均高于對照組。

量化分析表明在143B和PC3腫瘤模型中，BTB-RGD NP治療組小鼠的平均信號背景比(T/NT)分別為~14.2和8.1，而相應的BTB-RGD NP治療組小鼠的平均信號背景比(T/NT)僅為5.0和4.9。對體外熒光成像結果的定量分析表明，注射BTB-RGD納米顆粒的小鼠的這些器官和組織都發(fā)出了不同信號強度的熒光。注射的BTB-RGD納米粒主要分布于腫瘤、肝臟、脾臟和淋巴結。皮膚樣本也顯示出熒光信號，表明btb-RGD納米粒由于與皮膚組織中表達的整合素αvβ3具有很高的結合親和力而被保留。除了熒光成像外，光聲斷層掃描(PAT)也被用來進一步證實btb-RGD納米粒在腫瘤部位的整體靶向作用(圖4c)。這些結果成功地展示了BTB納米粒子在雙模式生物成像應用中的巨大潛力。

一方面，利用NIR-II熒光成像的高靈敏度，成功地實現(xiàn)了腫瘤邊緣的二維清晰可視化。另一方面，雖然與熒光成像相比，PAT的時間分辨率和靈敏度相對較低，但它可以提供更好的空間分辨率和三維可視化。這有利于腫瘤組織體積圖像的重建，具有很高的臨床應用價值。例如，醫(yī)生可以在三維上評估腫瘤組織的體積信息，并在單次注射造影劑后進行熒光成像引導的腫瘤切除手術。因此，使用單一造影劑將這兩種成像方式結合起來，為精確的血管成像和癌癥治療提供了很好的機會。

參考文獻

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近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system 

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀

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 恒光智影

       上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，專注于近紅外二區(qū)成像技術。致力于為生物醫(yī)學、臨床前和臨床應用等相關領域的研究提供*的、一體化的成像解決方案。自主研發(fā)近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng)-MARS。

       與基于可見光波長的傳統(tǒng)成像技術相比，我們的技術側重于X射線、紫外、紅外、短波紅外、太赫茲范圍，可為腫瘤學、神經(jīng)學、心血管、藥代動力學等一系列學科的科研人員提供清晰的成像效果，助力科技研發(fā)。

       同時，恒光智影還具備探針研發(fā)能力，我們已經(jīng)成功研發(fā)了超過15種探針，這些探針將廣泛地應用于眾多生物科技前沿領域的相關研究中。